Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.4 Die strukturellen und molekularen Grundlagen der siRNA-vermittelten RNAi
lem exogene nicht als pathogen erkannt werden. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass
siRNAs weder eine Interferonantwort noch die Aktivierung des Immunsystems über den Tolllike
Rezeptor (TLR) 3 auslösen [12, 13]. Dadurch unterscheiden sie sich von langen doppelsträngigen
RNA-Molekülen. Ihre charakteristischen 2 nt langen Überhänge an beiden Enden
machen siRNAs und miRNAs weiter unterscheidbar zu dsRNA-Fragmenten, die durch Degradation
entstehen und sorgen durch ihre Assoziation mit der PAZ Domäne für eine zielgerichtete
Programmierung des RISC [25].
Die 5'-Phosphatgruppe von siRNAs und miRNAs, die durch ihre Biogenese bedingt bzw.
im Falle von exogenen siRNAs Folge von Phosphorylierung im Zellinneren sind, ist eminent
wichtig für einen eektiven Einbau in den RISC [30, 32, 35, 170]. Darüber hinaus wird die
Phosphatgruppe für die Genauigkeit des target RNA slicing benötigt, da die Position der
Spaltstelle von der sicheren Verankerung des guide Stranges abhängig ist [12, 32, 62]. Die
Maskierung des 5'-Endes eines guide Stranges führt zu einer signikant reduzierten Genregulation,
wohingegen die Modikation des passenger Strang-5'-Endes keinen Eekt auf die RNAi
besitzt. Hingegen werden Modikationen des 3'-Endes beider Stränge gut toleriert [170173].
Klassischerweise tragen die 3'-Enden von siRNAs und miRNAs eine OH-Gruppe, während
piRNAs 2'-O-Methyl-Gruppen präferieren [174176].
Im Gegensatz zu den prokaryoten Homologen, deren guide Stränge aus DNA bestehen,
verwenden eukaryote Ago Proteine guide RNAs. Der wichtigste Grund hierfür liegt vermutlich
in den strukturellen Unterschieden der beiden Nukleinsäureklassen begründet. RNA-Helices
nehmen eine rechtsgängige A-Form Helix mit 11 bp pro Drehung und einem Durchmesser von
23 Å ein. Dagegen bilden DNA-Duplexe eine rechtsgängige Helix in B-Form, die mit 10 bp pro
Umdrehung und 20 Å Durchmesser kleiner ist. Weiterhin besitzt die Ribose der A-Form Helix
eine C3'-Endo-, diejenige der B-Form Helix eine C2'-Endo-Konformation. Dies führt zu einer
kompakteren Packung der A-Form Helix, und obwohl in einer Umdrehung ein Nukleotid mehr
untergebracht ist, ist die Länge der Umdrehung entlang der Achse mit 28 Å kürzer als bei der
B-Form Helix mit 34 Å. Die dichte Packung führt zu einer engen und tiefen groÿen Furche, in
der funktionelle Gruppen für Proteininteraktionen schlecht zugänglich sind [22, 170, 177].
Die regulatorischen RNAs liegen in der Zelle in doppelsträngiger Form vor, der aktive RISC
enthält jedoch nur den guide Strang. Für die Auswahl des einzubauenden Stranges gilt die
Instabilitätsregel: Es wird derjenige Strang als guide in Ago geladen, dessen 5'-Ende die gröÿere
thermodynamische Instabilität aufweist [178, 179]. In D. melanogaster bestimmt der Grad an
Fehlpaarung zwischen guide und passenger RNA in siRNAs und miRNAs, ob der guide Strang
mit Ago1 oder Ago2 assoziiert [180, 181].
Die letzte wichtige Komponente ist die zu regulierende target mRNA. Auch sie besitzt gewisse
charakteristische Merkmale. So muss sie eine oder mehrere Erkennungssequenzen besitzen,
die teilweise oder perfekt komplementär zum im RISC geladenen guide Strang sind. Diese
Sequenzen liegen häug im 3'-UTR der mRNA [16]. Die target RNA kann nur dann eektiv
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