Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen
Umsatz (%) =
I SP
I SP + I t
· 100 (4.6)
mit I SP = Intensität der Spaltproduktbande und I t = Intensität der Bande ungespaltener
target RNA.
Modizierte Spaltungsassays
Neben den uoreszenzbasierten Techniken stellten Spaltungsassays das wichtigste Instrument
für die Charakterisierung von hAgo2 in dieser Arbeit dar. Ausgehend vom Standard-
Spaltungsassay wurden für die Beantwortung bestimmter Fragestellungen die experimentellen
Bedingungen angepasst. Die Entwicklung dieser Experimente ist in Abschnitt 5.9 beschrieben.
Für die Untersuchung von Substratspezität und Kinetik der Spaltungsreaktion wurden verschiedene
Nukleinsäuren (einzelsträngige guide RNA, doppelsträngige siRNA, verschiedenfach
modizierte 5'-Enden) für unterschiedlich lange Zeit eingesetzt und die Auswirkungen beobachtet.
Weiterhin wurde die Spaltungsreaktion bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt
und der Einuss verschiedener Mg 2+ -Konzentrationen auf die Aktivität untersucht.
In weiteren Experimenten wurden dem minimalen Spaltungsansatz rekombinante dsRNAbindende
Proteine (hTRBP-His, hPACT-His) zugegeben, um ihren Einuss auf die Spaltungsreaktion
zu untersuchen. Für die Untersuchung der Spaltungsaktivität eines präassemblierten
ternären Komplexes wurde zuvor eine Inkubation in 1 × Ago2-Bindungspuer durchgeführt
und die Spaltungsreaktion durch Zugabe von Mg 2+ gestartet.
4.4.2 Ermittlung von Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten
Eine Dissoziationskonstante (K d ) dient der Beschreibung einer Gleichgewichtsreaktion, die
von der Assoziation und Dissoziation zweier Bindungspartner abhängig ist. Je höher K d ist,
umso weiter liegt das Gleichgewicht der Reaktion beim dissoziierten Zustand. K d stellt also
ein Maÿ für die Anität eines Proteins zu seinem Bindungspartner dar. Bei Gleichgewichtsreaktionen
in Lösung ist K d im thermodynamischen Sinn ausschlieÿlich von der Temperatur
abhängig, weshalb bei allen Experimenten zur Ermittlung von Dissoziationskonstanten die
Ansätze konstant temperiert wurden.
Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie
Eine Bindungsreaktion zwischen zwei Partnern kann anhand der Änderung eines Fluoreszenzsignals
analysiert werden. Ein Bindungspartner muss dabei die Fähigkeit zur Fluoreszenz
besitzen (z. B. uorophorgekoppelte guide RNA oder siRNA, siehe Abschnitt 3.8.2). Die Konzentration
des uoreszierenden Bindungspartners bleibt beim Experiment konstant, während
der andere Partner hinzu titriert wird. Gleichzeitig erfolgt die Anregung der Fluoreszenz.
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