Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
Präzipitationskontrolle in Abbildung 5.7 B.
Diese Erkenntnis stellte die Strategie einer Isolierung von vollständig translatiertem hAgo2
durch Verwendung einer C-terminalen Poly-His-Markierung in Frage. Deshalb wurden im Folgenden
mit dem aus inclusion bodies isolierten und durch 500 mM L-Arg partiell stabilisierten
hAgo2-His und His-hAgo2 Studien zu einer möglichen Reinigung durch Gröÿenauschlusschromatographie
durchgeführt.
Reinigung mittels Gröÿenausschlusschromatographie
Zunächst wurde mit Hilfe eines Gelltrationsstandards mit fünf Proteinen in einem Molekulargewichtsbereich
von 1,35 670 kDa für die verwendete Gelltrationssäule eine Eichgerade
erstellt und das Ausschlussvolumen ermittelt. Proteine bzw. deren Aggregate, die auf Grund
ihrer Gröÿe keine Wechselwirkung mit dem Säulenmaterial eingehen, werden nicht zurückgehalten
und verlassen deshalb das Säulenbett mit der Puerfront. Bei einer Säule mit 30 ml
Volumen und einer Flussrate von 0,5 ml/min ist das nach ca. 15 min der Fall. Dies konnte
experimentell bestätigt werden; Proteinaggregate wiesen eine Retentionszeit von 15,9 min auf.
A
hAgo2
H
B
H
hAgo2
A 280
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
kDa
A B C D E
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
-0,02
A B
C D E
95
72
55
43
34
A B C D E
Auftrag vor ÜS P A B C D E
Zentrifugation
Abbildung 5.8: Gröÿenauschlusschromatographie von hAgo2-His (A) und His-hAgo2 (B). Durchführung
siehe Text. Detektion durch Silbernitrat-Färbung. Die Banden vollständig translatierter Zielproteine
sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. t R : Retentionszeit. A E: Fraktionen. K: TCA-Kontrolle.
ÜS: Überstand nach Zentrifugation (entspricht der auf die Säule geladenen Proteinlösung, ist also
analog zur Spur Auftrag aus (A)). P: Sediment nach Zentrifugation.
K
98