Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
und ist somit konsistent mit derjenigen mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration ermittelten
(0,18 nM; siehe Abschnitt 5.8.2).
5.8.4 Zusammenfassung der biochemischen und kinetischen Parameter bei
der Bildung eines ternären Komplexes
Für eine bessere Übersicht sind die Ergebnisse zur Bindung der target RNA durch den binären
hAgo2/guide RNA-Komplex an dieser Stelle tabellarisch aufgeführt.
target RNA
K d (nM) k 1 k -1 k 2 k -2 k 3 k -3
FT ber. (M -1 s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 )
s2B-BHQ 0,18 2,8 × 10
0,09 8 11,8 0,0131 0,0048
s2B * 2,1 0,0024 0,0003
Tabelle 5.4: Übersicht über die biochemischen und kinetischen Parameter bei Bildung eines ternären
Komplexes. Mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration (FT) experimentell bestimmte oder berechnete
(ber.) Dissoziationskonstanten sowie Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten für die Bildung
eines ternären Komplexes aus binärem GST-hAgo2/guide RNA-Komplex und target RNA. * Für die
Berechnung der Dissoziationskonstante wurde der direkt mittels Verdrängungsexperiment ermittelte
Wert für k -1 verwendet.
5.9 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target
RNA-Spaltung durch hAgo2 6
Der zentrale Prozess bei der siRNA-vermittelten RNAi ist die sequenzspezische Spaltung der
target RNA an der kanonischen Position gegenüber dem Phosphatrückgrat zwischen dem 10.
und 11. Nukleotid des guide Stranges. Im Folgenden wurde dieser Prozess im Detail untersucht.
Dabei kamen sowohl Standard-Spaltungsassays als auch modizierte Spaltungsassays unter
Verwendung von GST-hAgo2 zum Einsatz, um diverse Fragestellungen zu beleuchten (siehe
Abschnitt 4.4.1).
Bereits in Abschnitt 5.5.2 konnte gezeigt werden, dass die in dieser Studie verwendeten
rekombinanten Proteine GST-hAgo2 und NHA-hAgo2 Spaltungsaktivität besitzen (siehe Abbildung
5.12 A, C und D). Dabei zeigte GST-hAgo2 mit über 90 % einen bemerkenswert hohen
Umsatz der target RNA. Dies erönete die Möglichkeit für vergleichende Experimente, bei denen
nur ein geringer Umsatz stattfand, so wie die Analyse der Spaltungsreaktion zu frühen
Zeitpunkten oder der Einsatz von doppelsträngiger siRNA.
6 Die in Abschnitt 5.9 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit S. Willkomm im
Rahmen der Betreuung ihrer Masterarbeit durchgeführt.
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