Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Abbildung 4.1: Schematischer Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers. Das Anregungslicht wird
von einer Xenon-Lampe ausgestrahlt und durch den Excitationsmonochromator Licht der Wellenlänge
492 nm herausgeltert. Dieses Licht trit auf die auf 25 ◦ C temperierte Protein-Nukleinsäure-Lösung
in der Küvette, wo FAM zur Fluoreszenz angeregt wird. Das emittierte Licht trit auf einen im rechten
Winkel angeordneten zweiten Monochromator, der Licht der Wellenlänge 516 nm passieren lässt. Als
Detektor dient ein Photomultiplier, der das Signal an einen angeschlossenen PC weiterleitet.
Im Falle der Bildung eines binären Komplexes aus hAgo2 und siRNA bzw. aus hTRBP und
siRNA wurde eine FAM-gekoppelte Nukleinsäure vorgelegt und das Protein hinzu titriert. Bei
Bindung beider Partner kommt es zur Abnahme des Fluoreszenzsignals. Für die Untersuchung
der Bildung eines ternären Komplexes aus hAgo2, guide RNA und target RNA wurde ein molecular
beacon verwendet. Dabei wurde in Ago2-Bindungspuer eine Präinkubation von guide
RNA und hAgo2 durchgeführt, so dass es zur Bildung eines binären Komplexes kam. Hierzu
wurde die mit dem Fluoreszenzlöscher BHQ1 gekoppelte komplementäre target RNA s2B-BHQ
titriert. Bei Bindung der target RNA an den binären Komplex kam es zur Löschung des von
FAM emittierten Lichts und dadurch zu einem Signalabfall. Analog wurde die Hybridisierung
von as2B-FAM und s2B-BHQ in Abwesenheit von hAgo2 untersucht.
Die Bestrahlung des Fluorophors mit Licht einer geeigneten Anregungswellenlänge sowie
die Detektion des Fluoreszenzsignals wurden mit dem FluoroMax R○ -3 Fluoreszenzspektrometer
vorgenommen (siehe Abbildung 4.1). In einer Fluoreszenzküvette mit 400 µl oder 700 µl
Fassungsvermögen wurde die zu bindende Nukleinsäure im entsprechenden Reaktionspuer
(siehe Tabelle 4.14) vorgelegt und der Bindungspartner schrittweise zugegeben. Nach gründlichem
Mischen wurde bis zum Erreichen eines stabilen Signals gewartet und der gemittelte
Messwert dokumentiert. Konzentrationen und Fluoreszenz wurden bezüglich der zunehmenden
Verdünnung korrigiert. Durch Temperierung des Küvettenhalters auf 25 ◦ C wurden Temperaturschwankungen
vermieden.
Die Daten wurden mit dem Programm DataMax 2.20 erfasst und mittels GraFit 5.0.6
mathematisch ausgewertet. Dazu wurde eine quadratische Gleichung an die experimentellen
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