Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
GST
hAgo2
kDa 1 2 3 1 2 3
170
130
95
72
55
Abbildung 5.9: Repräsentative anitätschromatographische Reinigung von GST-hAgo2 unter optimierten
Bedingungen im analytischen Maÿstab (siehe Abschnitt 4.3.8). Detektion durch Coomassie-
Färbung. Die Banden vollständig translatierter Zielproteine sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Für GST-hAgo2-His konnte eine weitere anitätschromatographische Reinigung unter Verwendung
der Poly-His-Markierung getestet werden. Es wurden, wie bereits bei den Reinigungsstudien
von hAgo2-His unter Verwendung der Poly-His-Markierung und nicht-denaturierenden
Bedingungen, Matrices mit immobilisierten Ni 2+ - oder Co 2+ -Ionen verwendet. Im ersten Fall
kam es zu einer unerwünschten Bindung E. coli eigener Proteine, was durch die Kontrolle
mit untransformierten BL21(DE3)-Zellen gezeigt wurde. GST-hAgo2-His konnte in den Elutionsfraktionen
nicht detektiert werden. Im zweiten Fall war die Bindung des Proteins an die
Matrix so schwach, dass eluiertes GST-hAgo2-His nur mit Hilfe einer Silbernitrat-Färbung im
SDS-Gel nachgewiesen werden konnte; die Menge war für eine Detektion mittels der weniger
sensitiven Coomassie-Färbung nicht möglich. Hier zeigte sich auÿerdem, dass eine Entfernung
von durch unvollständige Translation entstandenen kürzeren hAgo2-Varianten nur sehr bedingt
möglich war. Dies war bereits für hAgo2-His beobachtet worden (siehe Abschnitt 5.4.1).
Als zweite alternative Reinigungsmethode wurde eine Gröÿenausschlusschromatographie getestet,
wobei sich auch in diesem Fall zeigte, dass sich das verwendete GST-hAgo2 verhielt
wie die bereits untersuchten Konstrukte His-hAgo2 und hAgo2-His. Nach Äquilibrierung der
Säule mit GF-Puer und der Entfernung groÿer Aggregate durch Zentrifugation wurden 110µg
Protein für eine analytische Gelltration eingesetzt. Durch die Zentrifugation wurde etwa 50 %
des Proteins sedimentiert, und der eluierte Anteil wies vergleichbar viele Verunreinigungen auf
wie das eingesetzte Material.
Die beschriebenen Experimente zeigen, dass die gewählten Methoden keinen zusätzlichen
Reinigungseekt erbringen, jedoch die Ausbeute drastisch verringern. Für das Konstrukt GSThAgo2-His
wurde konstatiert, dass die C-terminale Poly-His-Markierung zum Einen den Nachteil
einer verminderten enzymatischen Aktivität zur Folge hatte (siehe Abschnitt 5.5.2) und
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