Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
Vergleichende Analyse der Michaelis-Menten-Kinetik
Zur weiteren Charakterisierung der siRNA-vermittelten Spaltung der target RNA durch hAgo2
und für einen Vergleich mit publizierten kinetischen Daten wurden die Parameter K m und
V max ermittelt (siehe Abschnitt 5.9.3). Tabelle 6.5 zeigt eine vergleichende Übersicht der in
dieser Arbeit ermittelten Werte mit solchen aus der Literatur. Statt der Berechnung von k cat
wurde die Ratenkonstante der Gesamtreaktion, die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt
repräsentiert, mit k cat gleichgesetzt.
RISC
K m V max [RISC] k cat k cat /K m
Referenz
(nM) (nMs -1 ) (nM) (s -1 ) (nM -1 s -1 )
GST-hAgo2 21,4 9,0 × 10 -4 n. b. 4 × 10 -4 1,9 × 10 -5 Abschnitt 5.9.3
und P-as2B
minimaler 2,3 7,1 × 10 -3 0,4 17,9 × 10 -3 7,8 × 10 -3 [168]
hRISC
rekombinanter 1,4 1,3 × 10 -3 0,15 8,7 × 10 -3 6,2 × 10 -3 [62]
hRISC
Tabelle 6.5: Vergleich verschiedener kinetischer Parameter der siRNA-vermittelten target RNA-
Spaltung. h: human. n. b.: nicht bestimmt.
Der in dieser Arbeit ermittelte K m -Wert ist 9- bis 15-fach gröÿer als die bislang publizierten
Werte von den Arbeitsgruppen um Martinez und Rivas. Der V max -Wert ist mit dem von Rivas
et al. vergleichbar, während zu demjenigen von Martinez et al. eine Abweichung um den Faktor
8 besteht. Die Wechselzahl k cat weicht von beiden Vergleichswerten um das 22- bis 43-fache
ab. Demnach unterscheiden sich auch die Werte k cat /K m um einen Faktor >300 [62, 168].
Die unterschiedlichen Werte können mehrere Ursachen haben. Zunächst muss beachtet werden,
dass der minimale hRISC von Martinez et al. durch eine Anitätsreinigung aus HeLa-
Zellextrakt isoliert wurde und deshalb vermutlich neben hAgo2 weitere Komponenten enthält,
die einen Einuss auf die untersuchten Parameter haben können [168]. Weiterhin wurde auch
das rekombinante hAgo2 von Rivas et al. unter abweichenden Expressions- und Reinigungsbedingungen
gewonnen [62]. Auÿerdem muss der Einuss verschiedener Substrate in Betracht
gezogen werden. Unterschiede in Sequenz, Länge oder Synthetisierung können sich auf die
kinetischen Parameter auswirken. Insbesondere die Ausbildung verschiedener Sekundärstrukturen
in langen target RNAs haben einen Einuss auf die Kinetik der Spaltungsreaktion [182
185, 200]. Die gröÿere katalytische Ezienz der Komplexe von den Arbeitsgruppen um Martinez
und Rivas hängt vermutlich maÿgeblich mit der imperfekten Reinigung von GST-hAgo2
zusammen. Vermutlich besitzt ein Teil der binären Komplexe keine enzymatische Aktivität, da
die Proteinpräparationen teilweise nicht vollständig translatiertes hAgo2 enthalten, das aber
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