Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
In beiden Experimenten konnte ohne den Zusatz von MgCl 2 keine target RNA-Spaltung beobachtet
werden. Bei der Präinkubation des Spaltungsansatzes ohne EDTA reichte die Zugabe
von 1 mM MgCl 2 aus, um eine Spaltung zu induzieren. Bei höheren MgCl 2 -Konzentrationen
war eine Abnahme der Aktivität zu verzeichnen (siehe Abbildung 5.14 A). Im Falle der Präinkubation
des Spaltungsansatzes mit 1 mM EDTA reichte die Zugabe von äquimolaren Mengen
MgCl 2 nicht aus, um die Spaltungsaktivität wieder herzustellen. Erst bei Konzentrationen,
die das vorhandene EDTA im Ansatz vollständig sättigten und darüber hinaus noch für GSThAgo2
zur Verfügung standen, trat ein Spaltprodukt mit der erwarteten Gröÿe auf (siehe Abbildung
5.14 B). Auch in diesem Fall führte die weitere Erhöhung der MgCl 2 -Konzentration
zu einer Inhibition der Spaltung.
In einem weiteren Experiment wurde die optimale MgCl 2 -Konzentration ermittelt, indem
ein Spaltungsansatz in 1 × Ago2-Bindungspuer für 10 min bei 37 ◦ C präinkubiert und die
Spaltung durch Zugabe von 0 3 mM MgCl 2 induziert wurde. Für jede MgCl 2 -Konzentration
wurde der target RNA-Umsatz gegen die Zeit aufgetragen und 0,5 mM MgCl 2 als optimale
Konzentration für die Induktion der Spaltung bestimmt (siehe Abbildung 5.14 C). Eine unter
diesen Bedingungen durchgeführte Spaltungsreaktion läuft mit einer vergleichbaren Geschwindigkeit
ab wie unter Standard-Spaltungsassay-Bedingungen (k gesamt = 0,0014 (± 0,0001) s -1 ).
5.5.5 Studien zum Oligomerisierungsverhalten von hAgo2
Zwar ist bekannt, das Argonaute Proteine in vitro eine Tendenz zur Aggregation besitzen,
allerdings wird dieser Umstand in sehr wenigen Publikationen diskutiert [257]. Die damit einhergehenden
Probleme sind vielfältig: zunächst ergeben sich Schwierigkeiten für eine eziente
Reinigung (siehe Abschnitt 5.4). Weiterhin kann man davon ausgehen, dass eine massive Proteinaggregation
einen Einuss auf die enzymatische Aktivität hat. Allerdings ist nicht bekannt,
ob die Bildung von groÿen Oligomeren eine biologische Relevanz besitzt. Die im Folgenden
beschriebenen Experimente zielten auf ein besseres Verständnis der hAgo2-Oligomerisierung
in vitro ab, um die Lagerung sowie Handhabung von hAgo2 zu optimieren und einen Eindruck
zu bekommen, welchen Einuss die Anwesenheit von Nukleinsäuren besitzt, die mit hAgo2
wechselwirken können.
Untersuchung mittels analytischer Gelltration
Erste Erkenntnisse über den Oligomerisierungsgrad von hAgo2 wurden mit Hilfe von analytischer
Gelltration gewonnen. Dafür wurden die Experimente, die im Rahmen der Reinigung
von hAgo2-His und His-hAgo2 bzw. GST-hAgo2 bereits durchgeführt worden waren (siehe
Abschnitt 5.4.1 und 5.4.2), herangezogen. Es hatte sich bereits gezeigt, dass hAgo2 teilweise
aggregiert vorlag und auf Grund der Komplexgröÿe keine Wechselwirkungen mit der Säulenmatrix
eingegangen war. Die verwendete Superdex 200 HR10/30 Gelltrationssäule besitzt
eine Ausschlussgröÿe von 1.300 kDa. Für die Konstrukte hAgo2-His und His-hAgo2 mit einem
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