Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.1 Molekularbiologische Methoden
Stains-All-Färbung
Die Visualisierung von Nukleinsäuren in PAA-Gelen erfolgte mit Hilfe des Farbstos Stains-
All. Auÿer DNA (blau, Maximum 620 nm) und RNA (blau-violett, Maximum 600 nm) können
damit auch Proteine (rot, Maximum ca. 515 nm) und Polysaccharide (verschiedene Farben,
Maxima 600 640 nm) gefärbt werden. Nach der Elektrophorese wurden PAA-Gele für 1
24 h in der Stains-All-Färbelösung (siehe Abschnitt 3.6) geschwenkt und im Anschluss zu
Dokumentationszwecken digitalisiert. Um eine mögliche Überlagerung der gefärbten Banden
mit Bromphenolblau und Xylencyanol zu verhindern, wurde Probenpuer ohne Farbstoe
verwendet. Die Nachweisgrenze für DNA und RNA liegt bei ca. 10 ng pro Bande.
SYBR R○ Gold-Färbung
Die Visualisierung von Nukleinsäuren ohne gleichzeitige Visualisierung von Proteinen in PAA-
Gelen erfolgte mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstos SYBR R○ Gold. Nach der Elektrophorese
wurden PAA-Gele für ca. 30 min in der SYBR R○ Gold-Färbelösung (siehe Abschnitt 3.6) geschwenkt.
Mit Hilfe des PhosphorImagers Typhoon TM 8600 wurden die Nukleinsäuren-Farbsto-Komplexe
bei einer Wellenlänge von 495 nm angeregt und das emittierte Licht detektiert.
Die Auswertung erfolgte mit dem Programm Image Quant 5.2. Um eine mögliche Überlagerung
der uoreszierenden Banden mit Bromphenolblau und Xylencyanol zu verhindern, wurde
Probenpuer ohne Farbstoe verwendet. Die Nachweisgrenze für DNA und RNA liegt bei ca.
1 ng pro Bande.
Autoradiographie
Als Autoradiographie bezeichnet man die Sichtbarmachung von chemischen Stoen durch
radioaktive Isotope, die eine Schwärzung auf einem Film hinterlassen oder deren Strahlung mit
Hilfe eines Strahlungsdetektors visualisiert werden kann. Dieses Verfahren wurde angewendet,
um mit [ 32 P] radioaktiv markierte RNA in PAA-Gelen (siehe Abschnitt 4.1.3) zu visualisieren.
Sequenziergele wurden vor der Exposition für 1 h bei 80 ◦ C getrocknet. Die Gele wurden
für bis zu 72 h auf einer [ 32 P]-sensitiven Bildplatte (Storage Phosphor Screen) exponiert, die
anschlieÿend mittels PhosphorImager Typhoon TM 8600 eingescannt wurde. Die Auswertung
erfolgte mit dem Programm Image Quant 5.2.
4.1.5 Nukleinsäure-Isolierung aus Agarosegelen
Für die weitere Verwendung von mittels präparativer TAE-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennten
Nukleinsäuren mussten diese isoliert werden. Dazu wurden die gewünschten Banden
mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit Hilfe des Wizard R○ SV Gel and PCR Clean-Up
Kits nach Herstellerangaben extrahiert.
55