Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
lich der Assemblierung eines ternären Komplexes, sind weitere Prozesse denkbar. Zum einen
kann die target RNA mit freiem GST-hAgo2 assoziieren. Allerdings löst diese Wechselwirkung
keine Signaländerung aus, was experimentell bestätigt wurde (siehe Abschnitt 5.8.1)
und geht daher nicht mit in die Messdaten ein. Auÿerdem führen die groÿen Unterschiede
in der Anität von GST-hAgo2 zu einer nicht-phosphorylierten einzelsträngigen RNA
(K d = 106 nM) im Vergleich zur Anität des binären Komplexes zu einer komplementären
target RNA (K d = 0,18 nM) dazu, dass die Bildung ternärer Komplexe bevorzugt abläuft.
Weiterhin können guide/target-Duplexe aus dem ternären Komplex dissoziieren und mit GSThAgo2
reassoziieren. Auch dieser Prozess ruft keine Signaländerung hervor (siehe Abschnitt
5.8.1) und verläuft durch einen geringeren K d (47,9 nM) vermutlich in schwächerem Ausmaÿ.
Weiterhin ist es denkbar, dass ein Teil des guide Stranges während der Assemblierung binärer
Komplexe nicht gebunden wird und deshalb frei in Lösung vorliegt. Nach Zugabe der target
RNA kann diese nun entweder an binäre Komplexe oder freie guide RNA binden. Bei diesem
möglichen Szenario besitzen beide Prozesse einen ähnlichen K d , weshalb sie parallel ablaufen
könnten und führen auÿerdem beide zu einer Signaländerung. Deshalb wurde die Bildung binärer
Komplexe vor Zugabe der target RNA sorgfältig kontrolliert. Das gewählte Verhältnis
von GST-hAgo2 (600 nM) zu guide RNA (20 nM) führte zu einer maximalen Signaländerung
von etwa 25 % (siehe Abschnitt 5.7.2). Als Kontrolle wurde in einem weiteren Experiment
die GST-hAgo2-Konzentration zur Bildung binärer Komplexe auf 1000 nM erhöht und anschlieÿend
target RNA hinzugefügt. Dieses Experiment erbrachte das gleiche Ergebnis wie bei
der Bildung binärer Komplexe aus 600 nM GST-hAgo2 und 20 nM guide RNA. Aus diesen
Gründen wird davon ausgegangen, dass der Groÿteil der guide RNA an GST-hAgo2 gebunden
vorliegt und deshalb nicht für eine proteinunabhängige Hybridisierung mit der target RNA
zur Verfügung steht.
Die Anität des binären Komplexes zur target RNA (K d = 0,18 nM) ist derjenigen des
nicht-proteingebundenen guide Stranges zur target RNA (K d = 0,38 nM) ähnlich. Dies ist ein
Hinweis darauf, dass die Erkennung und Bindung der target RNA hauptsächlich durch die
RNA-Komponente des binären Komplexes vermittelt wird. Bislang ist dieser Prozess noch
nicht ausreichend verstanden. Es gibt jedoch deutliche Hinweise darauf, dass die initiale Wechselwirkung
zwischen dem RISC und der target RNA durch den seed Bereich vermittelt wird
[200, 259]. Dieser wird im binären Komplex derart arrangiert, dass die Basen exponiert und
optimal zugänglich für die target RNA sind [119, 169]. Auÿerdem bilden im ternären Komplex
aus T. thermophilus Ago, einer guide DNA und einer target RNA Protein und target
RNA keine Wechselwirkungen aus, wohingegen eine Vielzahl von Wasserstobrückenbindungen
zwischen Aminosäureseitenketten und dem Phosphatrückgrat des guide Stranges entstehen
[119]. Bei Anitätsstudien mit dem Protein AfPiwi aus A. fulgidus, das nur eine Mid
und PIWI Domäne enthält, war der K d eines binären Komplexes zur target RNA 300-fach
höher als derjenige bei der Hybridisierung zweier RNAs in Abwesenheit des Proteins [267].
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