Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
6.3.2 Die Erkennung und Bindung der target RNA erfolgt durch
Wechselwirkungen mit der guide RNA
Der zweite Schritt bei der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung ist ihre Erkennung und
Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex. Dieser Prozess ist abhängig von der
Sequenz der guide RNA, was der RNAi ihre hohe Spezität verleiht. Demnach ist anzunehmen,
dass die Wechselwirkung zwischen target RNA und binärem Komplex hauptsächlich über die
beiden RNAs vermittelt wird. Als Voraussetzung für die experimentelle Untersuchung dieses
Schrittes ist es erforderlich, keine weiteren Prozesse zuzulassen als die Bildung des ternären
Komplexes. Hierfür konnten experimentelle Bedingungen gefunden werden. In Abwesenheit
von Mg 2+ bilden sich binäre Komplexe und eine Hybridisierung von guide und target RNA ist
möglich, allerdings wird die Spaltung der target RNA unter diesen Bedingungen verhindert
(siehe Abschnitt 5.8.1).
Eine target RNA besitzt eine oder mehrere Erkennungssequenzen, also Bereiche, die komplementär
zur guide RNA sind. Diese Bereiche können Watson-Crick-Basenpaarungen eingehen.
Erkennungssequnzen in endogenen target mRNAs nden sich meistens im 3'-UTR, insbesondere
bei den target RNAs von miRNAs [16]. Die Zugänglichkeit der Erkennungssequenzen ist
von groÿer Bedeutung für die Ezienz der RNAi. Je leichter eine Paarung zwischen guide und
target RNA erfolgen kann, desto gröÿer ist der RNAi-Eekt [182185, 200]. In dieser Arbeit
wurden zwei verschiedene target RNAs verwendet, die die gleiche Erkennungssequenz enthalten,
das ICAM-1-IVT sowie s2B. Ersteres ist 140 nt lang und enthält eine 19 nt lange Erkennungssequenz.
Durch eine theoretische Sekundärstrukturvorhersage mit Hilfe des Programms
mFold [245, 246] lässt sich sagen, dass die Erkennungssequenz mit groÿer Wahrscheinlichkeit
in einem ungepaarten Bereich vorliegt, so dass die Zugänglichkeit gewährleistet ist. Im zweiten
Fall enthält die target RNA s2B nur die um zwei Nukleotide verlängerte Erkennungssequenz.
Auf Grund ihrer geringen Länge von 21 nt ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich komplexe
Sekundärstrukturen bilden, sehr gering. In beiden Fällen kann deshalb davon ausgegangen
werden, dass die Zugänglichkeit der target RNA keinen limitierenden Faktor darstellt. Weiterhin
war weder im maximalen Umsatz noch in der Geschwindigkeit der Gesamtreaktion ein
signikanter Unterschied bei der alternativen Verwendung der langen und der kurzen target
RNA erkennbar.
Bei den Studien zur target RNA-Erkennung und -Bindung wurde zum Einen als guide RNA
das mit einem Fluorophor markierte P-as2B-FAM sowie das mit einem Fluoreszenzlöscher gekoppelte
s2B-BHQ verwendet. Hierbei handelt es sich um eine funktionelle target RNA (siehe
Abschnitt 5.10.1). Der Vorteil bei der Verwendung dieses molecular beacons ist die fast vollständige
Fluoreszenzlöschung und die damit einhergehende Güte der experimentellen Daten.
Auÿerdem erlaubt dieses System, vor der Assemblierung des ternären Komplexes die korrekte
Bildung binärer Komplexe aus GST-hAgo2 und P-as2B-FAM zu kontrollieren, da auch dieser
Assemblierungsschritt eine Fluoreszenzsignalabnahme hervorruft. Weiterhin wurden zwei ex-
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