Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.3.4 Detektion von Proteinen in Elektrophoresegelen und auf PVDF-Membranen
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3.5 Western-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.3.6 Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli Bakterien . . . . . . 69
4.3.7 Fraktionierung von bakteriellem E. coli Extrakt . . . . . . . . . . . . . . 70
4.3.8 Reinigung von rekombinanten Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.3.9 Konzentrierung von Proteinen in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.3.10 Untersuchung auf RNase-Kontamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen . 75
4.4.1 siRNA-vermittelte Spaltung von target RNA . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.4.2 Ermittlung von Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten . . . . . . . . . 77
4.4.3 Charakterisierung von Nukleinsäurebindungsreaktionen mittels transienter
Fluoreszenzmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.4 Gelverzögerungs-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.4.5 Untersuchung von Protein-Oligomerisierungszuständen . . . . . . . . . . 82
5 Ergebnisse 85
5.1 Vorarbeiten zu diesem Dissertationsprojekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
5.2 Strategien zur Gewinnung von rekombinantem hAgo2 für biochemische Studien 85
5.3 Expression von rekombinantem hAgo2 und hTRBP . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.3.1 Expression von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2 . . . . . . . . . 87
5.3.2 Klonierung von GST-hAgo2 und GST-hAgo2-His . . . . . . . . . . . . . 89
5.3.3 Studien zur Optimierung der Expression von GST-hAgo2 und GSThAgo2-His
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.3.4 Studien zur Optimierung der Expression von hTRBP-His . . . . . . . . 91
5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP . . . . . . . . . . . . . . . 93
5.4.1 Studien zur Reinigung von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2 . . . 93
5.4.2 Entwicklung eines Reinigungsprotokolls für GST-hAgo2 und
GST-hAgo2-His unter nicht-denaturierenden Bedingungen . . . . . . . . 99
5.4.3 Entwicklung eines Reinigungsprotokolls für hTRBP-His unter nicht-denaturierenden
Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2 . . . . . . . . . . . 105
5.5.1 Untersuchung der Präparationen auf Nuklease-Verunreinigungen . . . . 105
5.5.2 Überprüfung der sequenzspezischen Spaltungsaktivität . . . . . . . . . 106
5.5.3 Einuss der Temperatur auf die Spaltungsreaktion . . . . . . . . . . . . 108
5.5.4 Einuss der Mg 2+ -Konzentration auf die Spaltungsreaktion . . . . . . . 108
5.5.5 Studien zum Oligomerisierungsverhalten von hAgo2 . . . . . . . . . . . 110
iii