Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
5.5.3 Einuss der Temperatur auf die Spaltungsreaktion
Spaltungsexperimente wurden standardmäÿig bei einer Temperatur von 37 ◦ C durchgeführt.
Dahingegen fanden die Assoziations- und Dissoziationsstudien bei 25 ◦ C statt (siehe Abschnitte
5.7, 5.8 und 5.10), da Ago2 zur Aggregation neigt [257] und eine niedrigere Temperatur
der Bildung von Multimeren entgegenwirkt (siehe Abschnitt 5.5.5). Um zu testen, ob hAgo2
bei 25 ◦ C eine vergleichbare Spaltungsaktivität aufweist, wurde in einem Standard-Assay der
target RNA-Umsatz durch NHA-hAgo2 bei beiden Temperaturen getestet (siehe Abbildung
5.13).
Es ndet bei beiden Temperaturen eine vergleichbare Spaltung der target RNA statt. Der
maximale Umsatz bei 25 ◦ C ist mit etwa 84 %, verglichen zum maximalen Umsatz bei 37 ◦ C,
unwesentlich geringer. Daraus lässt sich ableiten, dass die bei 25 ◦ C beobachteten Assoziationsund
Dissoziationsprozesse von hAgo2 und verschiedenen Nukleinsäuren sich nicht wesentlich
von den bei 37 ◦ C untersuchten Spaltungsprozessen unterscheiden und eine Kombination der
gewonnenen Daten daher zulässig ist.
NHA
hAgo2
25°C 37°C
+ + + + - -
+ + + + + +
+ + + + - -
NHA-hAgo2
target RNA
guide RNA
t (min)
IVT (140 nt)
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
Abbildung 5.13: Spaltungsaktivität von NHA-hAgo2 bei verschiedenen Temperaturen (siehe Abschnitt
4.4.1). Standard-Spaltungsassay mit 2,4 µM NHA-hAgo2 mit anschlieÿender denaturierender
PAGE und Detektion mittels Autoradiographie. Zur Abtrennung von Proteinaggregaten erfolgte vor
dem Experiment eine Zentrifugation von NHA-hAgo2 bei 4 ◦ C und 150.000 × g für 1 h. M: Gröÿenmarker
(siehe Abschnitt 4.2.7). t: Zeit. IVT: ICAM-1 in vitro Transkript als target RNA.
5.5.4 Einuss der Mg 2+ -Konzentration auf die Spaltungsreaktion
Die RISC-vermittelte Spaltung von target RNA ist als ein Prozess beschrieben, der von divalenten
Metallkationen abhängig ist [26, 163]. Für anitätsgereinigtes hAgo2 konnte von
Ameres et al. gezeigt werden, dass die Zugabe von EDTA die Spaltung unterbindet. Durch
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