Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2 Einleitung
gestellt. Initial werden die langen doppelsträngigen RNA-Vorläufer-Moleküle durch Dicer im
Zytosol zu typischerweise 19 23 nt langen reifen siRNAs prozessiert [29, 31, 33] und durch
den RLC an den RISC übergeben. Für die Aktivierung des RISC muss der passenger Strang
aus dem Komplex entfernt werden, so dass die katalytische Komponente aus der Argonaute
Familie in menschlichen Zellen handelt es sich hierbei um hAgo2 durch den guide Strang
programmiert wird. Vermutlich wird die siRNA in doppelsträngiger Form geladen, der passenger
Strang durch Argonaute gespalten und aus dem RISC freigesetzt [5660]. Der RISC
ist nun in der Lage, sequenzspezisch target RNAs durch die Homologie von guide und target
RNA zu erkennen und zu binden. Bei perfekter Komplementarität wird die endonukleolytische
Spaltung der target RNA induziert. Charakteristischerweise erfolgt die Spaltung gegenüber der
Phosphatgruppe zwischen dem 10. und 11. Nukleotid des guide Stranges, betrachtet von seinem
5'-Terminus [31]. Die Spaltprodukte werden aus dem RISC entfernt, während der guide
Strang gebunden bleibt. Somit kann RISC multiple Runden von Katalyse durchlaufen [6163].
miRNA-vermittelte RNAi Die erste miRNA, lin-4, wurde in C. elegans entdeckt [64].
Mittlerweile sind unzählige miRNAs in Panzen, Algen, Tieren und dem Menschen bekannt
[41]. Der miRNA-vermittelte Weg der RNA-Interferenz zeichnet sich dadurch aus, dass guide
und target RNA nur partiell komplementär zueinander sind. Die Erkennungssequenzen liegen
sehr oft in der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR) der zu regulierenden mRNA [16]. Anders
als die meisten siRNAs sind miRNAs im Genom kodiert, so dass sie eine wichtige Rolle bei
einer Vielzahl zellulärer Prozesse spielen [1823].
Abbildung 2.1 B zeigt schematisch den Mechanismus der miRNA-vermittelten RNAi. Zunächst
erfolgt im Zellkern die Transkription der endogen kodierten miRNA-Vorläufer-Moleküle,
den primary (pri-)miRNAs durch die RNA-Polymerase II [6568]. Mehrere miRNA-Gene
existieren dabei in Gruppen, die vermutlich von einem gemeinsamen pri-miRNA-Transkript
stammen [41]. Die pri-miRNAs werden in Säugerzellen durch das Dicer-ähnliche RNase III-
Enzym Drosha und seinen dsRNA-Bindepartner DiGeorge syndrome critical region gene 8
(DGCR8) durch das Entfernen 5'- und 3'-terminaler Strukturen zu den etwa 60 70 nt langen
precursor (pre-)miRNAs prozessiert [65, 6972]. pre-miRNAs besitzen eine Stamm-Schleifen-
Struktur (stem loop) und die für die RNase III-Produkte typischen 5'-Phosphatgruppe sowie
2 nt lange Überhänge am 3'-Terminus [73]. Anschlieÿend erfolgt der von der GTPase Ran
abhängige Transport durch Exportin 5 ins Zytosol [7477]. Dort folgt die abschlieÿende Prozessierung
der pre-miRNA durch Dicer, vermutlich unterstützt durch TRBP, zur maturen
miRNA [29, 78, 79]. Die reife miRNA muss analog zum siRNA-vermittelten Weg aufgetrennt
werden, damit der guide Strang zur eektiven Beladung des RISC dienen kann. Allerdings
wird in diesem Fall wahrscheinlich ein spaltungsunabhängiger Prozess angewandt, bei dem
die beiden Stränge durch eine noch nicht identizierte Helikase entwunden werden [25, 36].
Der aktivierte RISC kann nun seine target mRNA binden. Dabei ist minimal die perfekte
Komplementarität der Nukleotide 2 8 des guide Stranges ausreichend, um eine Bindung zu
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