Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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Neue Erkenntnisse über die siRNA-Toleranz von hAgo2
Nachdem die Beladung von rekombinantem hAgo2 mit einzel- und doppelsträngiger siRNA
gelang, konnte auch die Spaltungsaktivität der Komplexe aus GST-hAgo2 und einzelsträngiger
guide RNA bzw. doppelsträngiger siRNA gezeigt werden (siehe Abschnitt 5.9.2). Der mit der
siRNA programmierte Komplex zeigte dieselbe sequenzspezische Spaltung an der kanonischen
Stelle wie derjenige, der mit einer einzelsträngigen guide RNA beladen worden war. Dieses
Ergebnis konnte nach eigenem Kenntnisstand bislang nicht gezeigt werden [35, 62, 199, 200]
und beruht vermutlich auf der hohen enzymatischen Aktivität des verwendeten GST-hAgo2.
Das Ergebnis impliziert, dass hAgo2 in der Lage sein muss, den passenger Strang aus dem
Hybrid zu entfernen. Dabei können aus den vorliegenden Experimenten keine Rückschlüsse
gezogen werden, ob dabei seine Spaltung oder eine Entwindung der komplementären Stränge
eine Rolle spielt. In der Literatur nden sich Hinweise, dass der Entfernung des passenger
Stranges seine Spaltung durch hAgo2 vorausgeht [36]. Vermutlich ist dieser Spaltungsschritt
von demjenigen der target RNA unterschiedlich [255]. Es steht zu vermuten, dass die Entlassung
der passenger Strang-Spaltprodukte in vergleichbarer Geschwindigkeit abläuft wie
diejenige der target RNA-Spaltprodukte. Dafür spricht, dass die Präinkubation von GSThAgo2,
P-si2B und komplementärer target RNA die Gesamtreaktion nicht beschleunigen kann
(siehe Abschnitt 5.9.2). Auf Grundlage dieser Erkenntnisse muss davon ausgegangen werden,
dass rekombinantes hAgo2 neben seiner Fähigkeit, target RNA zu spalten, auch siRNA-
Strangtrennungsaktivität besitzt und somit einen voll funktionsfähigen rekombinanten RISC
darstellt.
Die Abwesenheit der Phosphatgruppe am 5'-Ende des guide Stranges führte zu einer 15-
fach geringeren Anität (siehe Abschnitt 5.7.2). Ein solch gravierender Einuss konnte auf
den maximalen target RNA-Umsatz nicht beobachtet werden. Dieser lag nur um 9 % niedriger
als derjenige eines mit einem phosphorylierten guide Strang beladenen GST-hAgo2. Dies
impliziert, dass die Anzahl der aktiven ternären Komplexe, bei denen die korrekte Positionierung
des guide Stranges gelang, einen multiplen Umsatz durchführen. Eventuell werden
die Komplexe auch durch die Anwesenheit der target RNA stabilisiert, wie dies bereits durch
Dynamische Lichtstreuung gezeigt werden konnte (siehe Abschnitt 5.5.5).
In der Literatur sind zwei abweichende Ergebnisse beschrieben, die sich mit dem Einuss der
5'-Phosphatgruppe am guide Strang auf die Spaltungsreaktion beschäftigen. Liu et al. konnten
mit einer 21 nt langen, einzelsträngigen guide RNA ohne 5'-Phosphatgruppe in einem in vitro
Spaltungsexperiment keinerlei target RNA-Umsatz detektieren [35]. Im Gegensatz dazu zeigten
Lima et al. mit einer 19 nt langen guide RNA ohne 5'-Phosphatgruppe einen target RNA-
Umsatz, der knapp 10 % desjenigen durch eine 5'-phosphorylierte guide RNA vermittelten
betrug [199]. Im hier gezeigten Experiment konnte folglich mit OH-as2B als siRNA-Substrat
ein ungewöhnlich hoher Umsatz erzielt werden.
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