Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
guide RNA mindestens 50-fach schwächer bindet als doppelsträngige siRNA. Mit der endständig
markierten siRNA kam es nicht zu einer Hemmung der Substratbindung. Die ermittelte
Anität ist konsistent mit publizierten Daten, die K d s im subnanomolaren Bereich beschreiben
(siehe Tabelle 6.6). Allerdings konnten die beiden Bindungsmodi, die durch Yamashita
et al. beobachtet wurden, mit den im steady state durchgeführten Analysen in dieser Arbeit
nicht bestätigt werden. Die Abweichungen sind wie bereits in Abschnitt 6.3.1 ausführlich
erläutert auf Unterschiede in den Proteinpräparationen und Substraten sowie verschiedene
experimentelle Systeme zurückzuführen.
K d (nM)
Protein
experimentelles System
Substrat
Referenz
1,6 bakteriell exprimiertes FAM-siLam (21 nt) Abschnitt
rekombinantes hTRBP-His 5.11.1
1,0 bakteriell exprimiertes siLam (21 nt) Abschnitt
rekombinantes hTRBP-His 5.11.1
0,24/13,3 bakteriell exprimiertes siRNA (19 nt) [204]
(Bindungsmodus 1/2) rekombinantes His-hTRBP
0,29 in Sf9-Zellen exprimiertes 19-Duplex (19 nt) [258]
rekombinantes hTRBP
Tabelle 6.6: Vergleich verschiedener Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für Komplexe aus humanem
(h) TRBP und siRNA.
Die Anität von hTRBP-His zu doppelsträngiger siRNA ist 30-fach gröÿer als diejenige von
hAgo2 (siehe Abschnitt 5.7.2). Im zellulären Kontext würde dies implizieren, dass siRNAs mit
höherer Wahrscheinlichkeit nicht direkt an hAgo2 binden, sondern zunächst mit hTRBP assoziieren.
Diese Annahme bestätigt, dass es sich bei hTRBP um einen Faktor handeln könnte,
der die Beladung von hAgo2 durch siRNA vereinfacht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass
hTRBP in der Lage ist, hAgo2 zu einem Dicer/siRNA-Komplex zu rekrutieren und dadurch
eine Plattform für die RISC-Assemblierung darstellt [79]. Weiterhin stabilisiert hTRBP die
Assoziation von Dicer und hAgo2 [238]. Chakravarthy et al. konnten hTRBP eine Rolle bei
der Prozessierung von siRNA- und miRNA-Vorläufermoleküle durch Dicer nachweisen. Dabei
stabilisiert hTRBP den Komplex zwischen Dicer und seinem Substrat und führt zu 4- bis 5-
fach gröÿeren maximalen Umsatzgeschwindigkeiten und geringeren K m -Werten [258]. hTRBP
erhöht in einem TRBP/Dicer-Komplex die Substratanität im Vergleich zu Dicer allein, obwohl
auch dieses Enzym ein dsRNA-Bindemotiv aufweist [207, 208, 258]. Diese Sachverhalte,
also die Stabilisierung eines hAgo2/siRNA-Komplexes sowie die Erhöhung der Anität zu
doppelsträngiger siRNA, sind auch für einen Komplex aus hAgo2 und hTRBP denkbar.
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