Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
6.4.3 Die dsRNA-bindenden Proteine hTRBP und hPACT besitzen
vermutlich einen entgegengesetzten Einuss auf die
siRNA-vermittelte target RNA-Spaltung durch hAgo2
Da sich die RNA-Interferenz sowohl während der Initiation als auch bei ausführenden Schritten
doppelsträngiger RNA-Moleküle bedient, kommen dsRNA-bindenden Proteinen innerhalb des
Prozesses vermutlich eine wichtige Bedeutung zu. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, erste
Einsichten in die Rolle von hTRBP-His auf die siRNA-vermittelte target RNA-Spaltung in
einem in vitro System zu erhalten (siehe Abschnitt 5.12). Die derzeitige Datenlage weist darauf
hin, dass hTRBP-His die target RNA-Spaltung durch hAgo2 verstärkt. Da hTRBP-His und
siRNA vor dem Kontakt mit GST-hAgo2 präinkubiert wurden, liegen diese vermutlich in einem
Komplex vor, der danach mit der Schlüsselkomponente des RISC in Wechselwirkung tritt. Die
Spaltungsezienz von mit doppelsträngiger siRNA beladenem hAgo2 ist signikant geringer
als diejenige von mit einzelsträngiger guide RNA beladenem hAgo2 (siehe Abschnitt 5.9.2).
Deshalb wird vermutet, dass die siRNA von hTRBP-His auf GST-hAgo2 übergeben wird,
woraufhin es zu einer Strangtrennung und Freisetzung des passenger Stranges kommen muss,
damit der binäre hAgo2/guide RNA-Komplex die target RNA erkennen und binden kann. Ob
die Entwindung der komplementären Stränge durch hTRBP-His unterstützt wird, kann nicht
beantwortet werden. Für das homologe Protein R2D2 in D. melanogaster wurde bereits im
Jahr 2003 eine wichtige Rolle bei der Beladung von Ago2 entdeckt, die über die Fähigkeit,
dsRNA zu binden, vermittelt wird [271]. R2D2 dient als Biosensor für die Thermostabilität der
siRNA-Enden [236]. Es wird vermutet, dass TRBP und Dicer jeweils ein Ende doppelsträngiger
siRNA binden und so zu dessen Entwindung beitragen [146].
Neben der Steigerung des maximalen target RNA-Umsatzes durch hAgo2 wurde bei Einsatz
von hTRBP-His auch eine 6-fach gesteigerte Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet. Dies
würde implizieren, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion durch
hTRBP-His beschleunigt wird. Die in Abschnitt 5.10.2 beschriebenen Ergebnisse sowie die Literatur
[22, 63] deuten darauf hin, dass es sich beim limitierenden Schritt um die Freisetzung
der target RNA-Spaltprodukte aus dem ternären Komplex handelt. Also könnte hTRBP-His
bei der Regeneration des binären Komplexes assistieren und dadurch den multiplen Umsatz
beschleunigen. Da die beobachtete Ratensteigerung jedoch ohne Zugabe von ATP erfolgte,
kann es sich hierbei nicht um den bereits von Haley und Zamore beschriebenen Prozess handeln,
bei dem durch ATP der target RNA-Umsatz in Lysat aus D. melanogaster Embryonen
um das 4-fache gesteigert wurde [63].
Neben dem Einuss von hTRBP-His auf die target RNA-Spaltung durch hAgo2 wurde auch
der Einuss von hPACT-His auf die gleiche Reaktion untersucht (siehe Abschnitt 5.12). Obwohl
beide Proteine eine ähnliche Domänenstruktur sowie hohe Sequenzhomologie aufweisen
(siehe Abschnitt 2.6.1), haben sie einen entgegengesetzten Eekt. Ihnen wird auch eine konträre
Wirkweise bei der Modulation der PKR zugesprochen. TRBP inhibiert die Autophosphory-
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