Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen
Es wurden die zu untersuchenden Bindungspartner im entsprechenden Volumen adäquatem
Puer (siehe Tabelle 4.14) auf das Doppelte der nalen Konzentration eingestellt. Für die Bestimmung
von Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten wurden eine Protein- bzw. Komplexund
eine Nukleinsäuresubstratlösung getrennt voneinander in zwei Vorratsspritzen vorgelegt
und ihre Assoziation zeitaufgelöst beobachtet. Für die Bestimmung von Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten
wurde der Komplex aus Protein und Nukleinsäuresubstrat durch eine mehrminütige
Vorinkubation bei Raumtemperatur gebildet und seine Dissoziation zeitaufgelöst beobachtet,
indem ein geeigneter Kompetitor in 7 100 × molarem Überschuss die Reassoziation
verhinderte.
Die Messungen erfolgten in Mehrfachbestimmung; es wurden die Daten aus mindestens
drei unabhängigen Experimenten gemittelt. Um den Einuss des Puers sowie das Ausbleichen
des Fluorophors über einen längeren Messzeitraum zu berücksichtigen, wurde in einem
Kontrollexperiment im Fall von hAgo2 der Einuss des Lagerpuer-Messpuer-Gemischs, das
der jeweiligen Proteinkonzentration entsprach, bzw. im Fall von hTRBP der Einuss des reinen
Messpuers auf das Fluoreszenzsignal gemessen und die experimentell ermittelten Daten
bezüglich dieses Hintergrundsignals korrigiert. Die Datenaufzeichnung erfolgte mit den Programmen
Pro-Data SX und Pro-Data Viewer, die Auswertung wurde mit GraFit 5.0.6 vorgenommen.
Dabei wurde diejenige exponentielle Gleichung, die den Daten am besten entsprach,
an die Messpunkte angepasst und die sich ergebenden Geschwindigkeitskonstanten errechnet.
Diese wurden für eine bessere Übersichtlichkeit auf- oder abgerundet (für Werte gröÿer 1: 1
Nachkommastelle; für Werte zwischen 0,1 und 1: 2 Nachkommastellen; für Werte kleiner 0,1:
4 Nachkommastellen).
4.4.4 Gelverzögerungs-Analysen
Diese Methode (auch electrophoretic mobility shift assay, EMSA) kann zwischen proteingebundenen
und ungebundenen Nukleinsäuren in einem Elektrophoresegel unterscheiden, da
Komplexe auf Grund ihrer Gröÿe eine geringere Mobilität aufweisen und sie also verzögert
werden. Sie diente der Untersuchung der Komplexbildung zwischen hTRBP-His und doppelsträngiger
siRNA zum Nachweis der korrekten Faltung des Proteins nach seiner Reinigung
sowie dem Nachweis der Komplexbildung zwischen hAgo2 und guide RNA.
Für die Bindungsreaktion von hTRBP-His und siRNA wurden in 15 µl Ansätzen 700 nM
si2B-FAM mit steigenden Mengen (300 3300 nM) hTRBP-His gemischt und für 10 min bei
25 ◦ C inkubiert. Als Kontrolle diente as2B-FAM als Substrat bzw. die Kompetition eines Komplexes
aus 700 nM si2B-FAM und 2700 nM hTRBP-His mit steigenden Mengen (100 6700 nM)
si2B. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte mit Hilfe von nicht-denaturierender PAGE
(entweder 8 % konstant oder 4 20 % als Gradient, siehe Abschnitt 4.1.3). Die Visualisierung
der Fluoreszenz erfolgte mit dem PhosphorImager Typhoon TM 8600. Für eine Abschätzung der
Anität wurden die Banden mittels Image Quant 5.2 quantiziert und mit GraFit 5.0.6 aus-
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