Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2
entsprechenden Elutionsfraktionen vereinigt und einer Anionenaustausch-Chromatographie
unterzogen, da hTRBP einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 6,35 aufweist und somit
bei pH 7,5 eine negative Nettoladung besitzt. Hierzu wurde eine TMAE Sepharose Source 15
Säule verwendet. Bei der Elution durch einen biphasischen Gradienten (0 1 M NaCl in 30 min,
1 2 M in 5 min) konnte hTRBP-His nicht annähernd quantitativ eluiert werden, wie eine spätere
SDS-PAGE-Analyse zeigte. Die Annahme, dass das Zielprotein auf der Säule aggregiert
war und sich deshalb nicht eluieren lieÿ, bestätigte sich durch das Spülen mit 3 × 1 ml 1 M
NaOH. Bei der Analyse der derart eluierten Fraktionen konnte hTRBP-His in einem SDS-Gel
detektiert werden.
Im zweiten experimentellen Ansatz wurden etwa 13 g Bakterienzellen lysiert und hTRBP-
His wie unter Abschnitt 4.3.8 beschrieben gereinigt. Im Gegensatz zum oben beschriebenen
experimentellen Ansatz führte die Verwendung eines linearen Imidazolgradienten bei der Proteinelution
dazu, dass geringer an gebundene, verunreinigende Proteine vor dem Zielprotein
eluierten und daher für hTRBP-His ein hoher Reinheitsgrad erzielt werden konnte (siehe Abbildung
5.11 B).
Nach Vereinigung der hTRBP-His enthaltenden Fraktionen erfolgte eine Dialyse gegen glyzerinhaltigen
Lagerpuer sowie ggf. die Konzentrierung mittels Ammoniumsulfat-Fällung oder
Ultraltration und die Lagerung von hTRBP-His bei 20 ◦ C. Bei einer ersten präparativen
Reinigung konnten pro g Bakterienzellen 0,3 mg (A 280 ) hTRBP-His gereinigt werden, wobei
durch Präzipitation während der Dialyse ca. 30 % Verlust zu verzeichnen war. Bei einer zweiten
Reinigung el die Ausbeute mit 1,5 mg (A 280 ) Protein pro g Bakterienzellen höher aus,
wobei es kaum zu Präzipitation während der Dialyse kam.
5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem
hAgo2 3
5.5.1 Untersuchung der Präparationen auf Nuklease-Verunreinigungen
Alle hAgo2-Präparationen wurden, wie unter Abschnitt 4.3.10 beschrieben, auf die Anwesenheit
von kontaminierenden Nukleasen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die NHA-hAgo2-
und hAgo2-His-Präparationen keine detektierbare Nuklease-Kontamination enthielten (siehe
Abbildung 5.12 A und B). Die Präparation von His-hAgo2 hingegen wies eine starke Kontamination
auf. Diese Präparation wurde nicht für weitere Untersuchungen verwendet. Da die
Reinigung von GST-hAgo2 in mehreren Chargen erfolgte, konnten diese separat auf eine mögliche
Kontamination untersucht werden. Alle Chargen wiesen eine leichte Kontamination auf,
eventuell bedingt durch die native Reinigungsstrategie. Deshalb wurden die mit GST-hAgo2
durchgeführten Studien bei Bedarf in Anwesenheit von RNase-Inhibitoren durchgeführt bzw.
3 Die in Abschnitt 5.5 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit S. Weiÿbach und
S. Willkomm im Rahmen der Betreuung ihrer Bachelor- bzw. Masterarbeit durchgeführt.
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