Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.7 Ziel dieser Arbeit
der Freisetzung der reifen siRNA durch Dicer diese bei der Übergabe an Ago stabilisieren und
korrekt positionieren [238, 241]. Die Funktion von TRBP als Biosensor für die unterschiedliche
thermodynamische Stabilität der beiden siRNA-Enden verschat ihm eine mögliche Rolle als
Prüfer für den Einbau des korrekten Stranges als guide RNA in Ago [79, 238, 241].
2.7 Ziel dieser Arbeit
Die detaillierte Kenntnis der Wirkungsweise von hAgo2, der zentralen Komponente des humanen
RISC bei der RNAi, ist von besonderer Bedeutung. Die Charakterisierung von rekombinanten
Proteinen in in vitro Studien erönet die Möglichkeit, beobachtete Eekte auf genau
denierte Komponenten der RNAi-Maschinerie zurückzuführen. Im Gegensatz dazu ist bei Experimenten
mit Zellextrakten oder immunpräzipitiertem Protein, das an unbekannte Faktoren
gebunden vorliegen kann, diese eindeutige Zuordnung nicht möglich. Durch Auftrennen der
siRNA-abhängigen hAgo2-vermittelten Spaltung von target RNA in Teilreaktionen (Bindung
des guide Stranges, Bindung der target RNA, ihre Spaltung und Freisetzung der gespaltenen
Fragmente aus dem RISC) können diese Schritte im Detail charakterisiert werden. Da für
hAgo2 in seiner gesamten Länge bisher keine Kristallstruktur gelöst werden konnte, können
biochemische Daten wertvolle Hinweise nicht nur auf die Funktion des Proteins liefern, sondern
auch die von prokaryoten Homologen sowie einzelnen Domänen des hAgo2 abgeleiteten
Strukturinformationen komplementieren. Aus diesen Gründen beschäftigt sich die vorliegende
Arbeit mit den im Folgenden beschriebenen Abschnitten.
Zunächst bestand die Notwendigkeit, ein Expressionssystem für rekombinantes hAgo2 zu
etablieren und mit Hilfe einer geeigneten Reinigungsstrategie in ausreichender Menge und
Qualität zu isolieren. Weiterhin sollten adäquate Lagerbedingungen gefunden sowie die Handhabung
des Proteins für den experimentellen Einsatz erprobt werden. Zentrales Ziel des Projektes
war die Durchführung von quantitativen biochemischen Analysen. Es sollte die Substratbindung
durch hAgo2 bezüglich Anität und Kinetik charakterisiert werden. Auÿerdem
sollte eine Charakterisierung der sequenzspezischen target RNA-Spaltung durch hAgo2
durchgeführt werden. Mit Hilfe der experimentell ermittelten Parameter sollte ein minimales
kinetisches Modell der siRNA-abhängigen hAgo2-vermittelten target RNA-Spaltung etabliert
werden.
Neben hAgo2 sollte mit hTRBP eine weitere Komponente des RISC untersucht werden. Ziel
war es, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln, um rekombinantes
hTRBP für in vitro Studien zu gewinnen. Nach einer Charakterisierung bezüglich Nukleinsäurebindungseigenschaften
und Oligomerisierungsverhalten sollte der Einuss von hTRBP auf
die Bindung von siRNA bzw. Spaltung von target RNA durch hAgo2 untersucht werden.
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