Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
4.1 Molekularbiologische Methoden
4.1.1 PCR
Für die Amplikation von DNA-Fragmenten wurde eine PCR mit Hilfe des Phusion PCR Kits
durchgeführt. Ein Ansatz enthielt in 1 × HF-Puer neben 10 ng pET41b(+)-hAgo2-His (siehe
Abschnitt 3.8.1) als Vorlage je 0,5 µM vorwärts (fwd) bzw. rückwärts (rev) gerichteten Primer,
200 µM pro dNTP und 0,02 u/µl Phusion Polymerase. Tabelle 4.1 gibt eine Übersicht über die
verwendeten Primer sowie Temperaturprole. Im Anschluss wurden die Amplikate mit Hilfe
einer TAE-Agarose-Gelelektrophorese (siehe Abschnitt 4.1.3) analysiert.
Primer Temperaturprol Amplikonlänge (bp)
Klonierung GST-hAgo2-His
Ago2 fwd AII 98 ◦ C für 30 s 2602
Ago2 rev AgeI 30 Zyklen
98 ◦ C für 10 s
72 ◦ C für 60 s
72 ◦ C für 600 s
4 ◦ C, ∞
Klonierung GST-hAgo2
Ago2 fwd AII 98 ◦ C für 30 s 2605
Ago2 rev AgeI Stopp 30 Zyklen
98 ◦ C für 10 s
72 ◦ C für 60 s
72 ◦ C für 600 s
4 ◦ C, ∞
Tabelle 4.1: Für die Amplikation von DNA-Fragmenten verwendete Primer sowie Temperaturprole.
4.1.2 Gewinnung von Plasmid-DNA
Plasmid-DNA wurde aus E. coli Zellen in Abhängigkeit der gewünschten Ausbeute mit Hilfe
zweier Kits isoliert.
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