Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
gewertet; allerdings diente die ermittelte apparente Dissoziationskonstante nur als Richtwert.
Für die Überprüfung der Komplexbildung aus hAgo2 und guide RNA wurde in einem Volumen
von 15 µl 5 nM radioaktiv markierte Nukleinsäure (siehe Abschnitt 4.2.6) mit 0 nM oder
2500 nM NHA-hAgo2 in Ago2-Spaltungspuer ohne KCl gemischt und für 90 min bei 4 ◦ C inkubiert.
Die Ansätze wurden auf einem nicht-denaturierenden 8 % PAA-Gel elektrophoretisch
aufgetrennt und per Autoradiographie detektiert (siehe Abschnitt 4.1.4).
4.4.5 Untersuchung von Protein-Oligomerisierungszuständen
Fraktionierung von Proteinlösungen durch Zentrifugation
Für die Separation unterschiedlich groÿer Proteinaggregate oder Multimere von kleineren Proteinpopulationen
wurde die zu untersuchende Proteinlösung für 1 h bei 4 ◦ C und 20.000 × g
oder 150.000 × g zentrifugiert und die Überstände oder Sedimente analysiert. Dies erfolgte
alternativ durch SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4.3.3) mit anschlieÿender Coomassie-Färbung
(siehe Abschnitt 4.3.4), mittels analytischer Gelltration oder Dynamischer Lichtstreuung
(siehe unten).
Analytische Gelltration
Die analytische Gelltration wurde zum Einen verwendet, um die Möglichkeit einer Reinigung
von hAgo2 durch Gröÿenausschlusschromatographie zu testen. Zum Anderen wurden
Erkenntnisse über das Oligomerisierungsverhalten von hAgo2 und hTRBP gewonnen.
Es wurden eine HPLC-Anlage sowie die Superdex 200 HR10/30 Gelltrationssäule verwendet,
die zunächst mit dem adäquaten Puer bei einer Flussrate von 0,5 ml/min äquilibriert
wurde. Es folgten die Injektion der zu trennenden Proteinlösung in das Laufmittel und die
Dokumentation des Chromatogramms über einen Zeitraum von 50 min. Für den Nachweis von
Proteinen wurden anhand des Chromatogramms Fraktionen gesammelt, bei Bedarf mit TCA
gefällt (siehe Abschnitt 4.3.2) und mit SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4.3.3) und anschlieÿender
Coomassie- oder Silbernitrat-Färbung (siehe Abschnitt 4.3.4) analysiert.
Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Wenn Licht in eine Lösung von Partikeln eingestrahlt wird, kommt es zu verschiedenen Wechselwirkungen.
Neben der Absorption, bei der Photonen Teilchen anregen und ihre Abwesenheit
nach Durchstrahlen einer Lösung registriert wird, kommt es auch zur Streuung von Licht.
Hierbei werden keine Photonen absorbiert, jedoch ihre Richtung geändert. Man unterscheidet
elastische (Rayleigh-) Streuung, bei der keine Energieübertragung zwischen dem Photon und
seinem Streuzentrum auftritt, so dass das eingestrahlte Photon die gleiche Frequenz besitzt wie
das abgelenkte, und inelastische (Raman-) Streuung. Hierbei kommt es zu einer Wechselwirkung
zwischen Photon und Streuzentrum, bei dem ein oszillierendes Dipolmoment induziert
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