Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.11 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
die Spaltungsreaktion durch Zugabe von 20 nM s2B-BHQ gestartet. Nach Inkubation für 2 h
bei 25 ◦ C wurde die Temperatur um je 1 ◦ C erhöht und das Fluoreszenzsignal protokolliert.
In einem Temperaturbereich von 25 60 ◦ C konnte keine Änderung des Fluoreszenzsignals
verzeichnet werden. Folglich kann durch eine Temperaturerhöhung weder die Freisetzung der
gespaltenen noch der ungespaltenen target RNA induziert werden, die basierend auf der berechneten
Schmelztemperatur in Abwesenheit von GST-hAgo2 bei Temperaturen über 30 ◦ C
respektive 53,2 ◦ C nicht mit einem komplementären RNA-Strang hybridisieren würde.
Daraus lässt sich schlieÿen, dass GST-hAgo2 einen stabilisierenden Einuss auf die hybridisierten
Nukleinsäuren besitzt. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der sehr langsamen Dissoziationsrate
von ternären Komplexen, die gespaltene oder ungespaltene target RNA enthalten
und ein weiterer Hinweis auf die Existenz eines die Spaltproduktfreisetzung erleichternden
Faktors. Die Identität dieses Faktors muss allerdings noch aufgeklärt werden.
5.11 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP 7
Als Bestandteil des minimalen RLC spielt hTRBP eine Rolle bei der RNAi [79, 216, 235, 256].
Allerdings ist bisher nicht vollständig geklärt, worin die Aufgabe dieses dsRNA-bindenden
Proteins besteht. Es besteht die Möglichkeit, dass hTRBP die Beladung von hAgo2 mit doppelsträngiger
siRNA erleichtert. Daher ist die Untersuchung der Bindung von hTRBP an
doppelsträngige siRNA ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Beladung des RISC.
5.11.1 Anität von hTRBP zu verschiedenen siRNA-Substraten
Bestimmung der Anität zu intern markierter dsRNA und ssRNA
Für die Untersuchung der Anität von hTRBP-His zu verschiedenen siRNA-Substraten wurden
Dissoziationskonstanten durch Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie bestimmt (siehe
Abschnitt 4.4.2). Als Substrat diente zunächst die doppelsträngige si2B-FAM, die bereits für
Gelverzögerungs-Analysen verwendet worden war (siehe Abschnitt 5.6.2). Als apparente Dissoziationskonstante
konnte K d, app = 120 (± 45) nM ermittelt werden. Als Kontrolle diente die
einzelsträngige guide RNA as2B-FAM. Die apparente Dissoziationskonstante für dieses Substrat
ist näherungsweise mindestens 50-fach gröÿer. Abbildung 5.44 zeigt die Titrationskurven
von si2B-FAM (A) und as2B-FAM (B) mit hTRBP-His.
Bei der Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von hTRBP-His mit si2B-FAM (siehe Abbildung
5.44 A) konnte eine Gesamtuoreszenzänderung von ca. 16 % erzielt werden. Die mathematische
Auswertung der Titrationskurve mit Hilfe einer quadratischen Bindungsgleichung
ergab eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 126,8 (± 8,0) nM. Bei der Titration von
as2B-FAM mit hTRBP-His konnte auf Grund der geringen Anität von hTRBP-His zu
7 Die in Abschnitt 5.11 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit J. Heidemann
im Rahmen der Betreuung seiner Bachelorarbeit durchgeführt.
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