Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
des benötigten L-Arg zur Folge hatte und deshalb in kurzer Zeit zur Präzipitation von hAgo2
führte. Um eine schnelle Aggregation von GST-hAgo2 zu verhindern, wurde darauf verzichtet,
die die Löslichkeit erhöhende N-terminale GST-Markierung durch Proteaseverdauung zu entfernen,
obwohl diese Möglichkeit durch die gewählte Klonierungsstrategie gegeben ist (siehe
Abschnitt 5.3.2). Es konnte bereits früher durch Rivas et al. gezeigt werden, dass GST allein
keine target RNA-Spaltung vermitteln kann. In der gleichen Arbeit wurde die erste bakterielle
Expressionsstrategie für hAgo2 beschrieben. Im Gegensatz zu dieser konnte in der vorliegenden
Arbeit auf die Koexpression von Hsp90 verzichtet werden [62].
Neben der bakteriellen Expression von hAgo2 besteht die Möglichkeit der Expression in
Insektenzellen [199, 256], was eine korrekte posttranslationale Modikation ermöglicht. Weiterhin
gibt es die Möglichkeit, hAgo2 aus humanen Zellextrakten mittels immun- oder anitätsbasierten
Techniken zu isolieren [35, 79, 168, 200, 260]. Beide Strategien versprechen eine
bessere Löslichkeit sowie eine vollständige Translation. Jedoch sind die Ausbeuten derart exprimierter
Proteine oft sehr gering. Auÿerdem besteht das Risiko der Koisolierung von zellulären
Faktoren, wie es bereits mehrfach beschrieben ist [168, 200]. Bei dem durch die Arbeitsgruppen
um Martinez und Ameres verwendeten anitätsgereinigten minimalen RISC ergibt sich
eine zusätzliche Einschränkung für die Untersuchung der siRNA-Bindung durch hAgo2. Sie
isolierten hAgo2 durch Bindung an mit einer Biotin-Markierung versehenen siRNA, so dass
eine in vitro Studie der siRNA-Bindung unmöglich ist [168, 200]. Ein derart isolierter minimaler
RISC kann nicht mit einzelsträngiger oder doppelsträngiger siRNA erneut geladen werden
[261].
Im zellulären Umfeld bindet ein programmierter RISC in Abhängigkeit der guide RNA-
Sequenz eine mRNA, um ihre Translation zu verhindern. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten
in vitro Spaltungssystem wurde als target RNA entweder eine 140 nt lange, in vitro transkribierte
RNA oder eine 21 nt lange synthetische RNA als Modell für eine target mRNA verwendet.
In beiden Fällen fehlen die für eine mRNA typischen Enden, die 5'-terminale m 7 G cap
Struktur sowie der 3'-terminale Poly-A-Schwanz. Auÿerdem sind beide Modell-RNAs kürzer
als ein zelluläres mRNA-Transkript. Dennoch stellen die beiden verwendeten RNAs spaltbare
targets für hAgo2 dar (siehe Abschnitte 5.5.2 und 5.9). In der Literatur wird eine Beteiligung
der m 7 G cap Struktur bei der target RNA-Erkennung und -Bindung kontrovers diskutiert
[158]. Djuranovic et al. beschrieben eine allosterische Ligandenbindungsstelle innerhalb
der D. melanogaster Ago1 Mid Domäne, die zusätzlich zur Bindetasche für das 5'-Ende des
guide Stranges existiert. Diese kann u. a. das cap Analogon m 7 GpppG binden und erhöht
dadurch die Anität zu einer miRNA [157]. Auch für hAgo2 ist eine mögliche Bindung der
cap Struktur, ähnlich der durch eIF4E, beschrieben. Hierfür werden vor allem zwei Phenylalanine
verantwortlich gemacht [162]. Allerdings zeigen neuere strukturelle Studien der humanen
Mid Domäne, dass die entsprechenden Aminosäuren sich nicht an der Proteinoberäche benden
[128]. Die Beteiligung der m 7 G cap Struktur an der siRNA- oder miRNA-Bindung durch
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