Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
einer Beeinträchtigung der Komplexbildung. Demnach ist eine eektive Beladung von hAgo2
durch einzel- oder doppelsträngige siRNA nach der initialen Bildung eines Kollisionskomplexes
maÿgeblich durch die Verankerung des guide RNA-5'-Endes determiniert. Dieses Ergebnis
steht im Gegensatz zu dem theoretischen Modell, dass die Erkennung der siRNA durch eine
Wechselwirkung der 3'-terminalen Überhänge mit der PAZ Domäne vermittelt wird [25].
Anhand der transientenkinetisch ermittelten Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten
lässt sich ein K d für die Komplexe aus GST-hAgo2 und den drei verschiedenen siRNA-
Substraten berechnen. Diese weichen zum Teil erheblich von den unter Gleichgewichtsbedingungen
experimentell bestimmten Werten ab (siehe Tabelle 5.2). Eine mögliche Erklärung
hierfür besteht darin, dass in Messungen unter pre-steady state Bedingungen die langsame
Diusion von teilweise oligomerisiertem hAgo2 ins Gewicht fällt, was unter steady state Bedingungen
nicht der Fall ist. Dies wird durch den Vergleich der Diusionsgeschwindigkeit der
Reversen Transkriptase von HIV-1 gestützt, die mit 117 kDa ein ähnlich groÿes Protein ist
und deshalb mit vergleichbarer Geschwindigkeit diundieren sollte. Die Assoziationsratenkonstante
zweiter Ordnung der Kollisionskomplexbildung mit einem DNA/RNA-Hybrid beträgt
k 1, HIV-1 RT = 5,4 × 10 8 M -1 s -1 , die zugehörige Dissoziationsratenkonstante k -1, HIV-1 RT = 18 s -1
[266]. Damit ist die Assoziation etwa 10-fach schneller als diejenige von hAgo2 mit einer
guide RNA (k 1, hAgo2 = 0,6 × 10 8 M -1 s -1 ), wohingegen der zugehörige Dissoziationsprozess nur
etwa 3-fach schneller ist (k -1, hAgo2 = 6,2 s -1 ). Es wäre weiterhin denkbar, dass durch die Oligomerisierung
die Domänenbewegung von hAgo2 eingeschränkt ist und dadurch die gesamte
Bindungsreaktion verzögert wird. Auÿerdem kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Bindungsreaktion
eine oder mehrere weitere Phasen durchläuft, die mit dem hier verwendeten
experimentellen System nicht beobachtbar sind und zusätzlich in den berechneten K d eingehen.
Schlieÿlich muss noch die Ungenauigkeit der ermittelten Messwerte berücksichtigt werden,
die sich bei der Berechnung des K d fortpanzen und deshalb ins Gewicht fallen. Trotz
der Abweichungen zwischen experimentell ermittelten und berechneten Werten zeigt auch der
Datensatz der berechneten K d s, dass die Anität von GST-hAgo2 zu einer einzelsträngigen,
phosphorylierten guide RNA am gröÿten ist, gefolgt von der Anität zu einer doppelsträngigen
siRNA, die einen phosphorylierten guide Strang enthält. Die beiden Werte unterscheiden
sich durch den Faktor 5. Die Abwesenheit der Phosphatgruppe am guide Strang verringert die
Anität zum guide Strang um den Faktor 21.
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