Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
5 Ergebnisse
GST
hAgo2
8000
6000
4000
2000
0
0 20 40 60 80
s2B-BHQ (nM)
Abbildung 5.32: Bestimmung der Anität des binären Komplexes zur target RNA (siehe Abschnitt
4.4.2). Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von einem binären Komplex aus 20 nM P-as2B-FAM und
600 nM GST-hAgo2 mit steigenden Konzentrationen s2B-BHQ. Die Auswertung der Daten erfolgte
mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab einen K d = 0,18 (± 0,04) nM.
in der Tat nicht zu einer Interaktion mit GST-hAgo2 auÿerhalb der basischen Bindungsfurche
zwischen den beiden Lappen kommen, da dieses target nicht darüber hinausragt. Für T.
thermophilus Ago im ternären Komplex mit einer 21 nt langen guide DNA und 20 nt langen
target RNA kommt es innerhalb dieser Bindungsfurche nicht zur Bildung intermolekularer
Wasserstobrückenbindungen zwischen der target RNA und Ago [119].
5.8.3 Kinetik der Bindungsreaktion von binärem Komplex und target
RNA
Untersuchung der Assoziation von binärem Komplex und target RNA
Im Folgenden wurde die Bildung des ternären Komplexes unter pre-steady state Bedingungen
untersucht. Hierfür kam erneut die stopped ow Technik zum Einsatz. Für die Beobachtung der
Assoziation des ternären Komplexes wurde zunächst das molecular beacon System verwendet
(siehe Abbildung 5.31 A). 600 nM GST-hAgo2 wurden mit 20 nM P-as2B-FAM gemischt und
für mindestens 15 min bei 25 ◦ C inkubiert, um die Bildung binärer Komplexe zu gewährleisten.
Danach wurden die binären Komplexe rasch mit s2B-BHQ konstanter Konzentration gemischt
und die Änderung des Fluoreszenzsignals verfolgt. Für jede target RNA-Konzentration wurden
die Daten mathematisch mit Hilfe einer exponentiellen Gleichung ausgewertet (siehe Abbildung
5.33 A).
Die Kinetik wird am besten durch eine dreifach exponentielle Gleichung beschrieben. Die
erste schnelle Phase (siehe Abbildung 5.33 A, Darstellung bis 0,8 s) besitzt eine Ratenkonstan-
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