Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A DNaseI & Triton Wasch 1 Wasch 2 Wasch 3 kDa Lysat ÜS P ÜS P ÜS P ÜS P 130 95 72 55 43 hAgo2 B DNaseI & Triton Wasch 1 Wasch 2 Wasch 3 kDa Lysat ÜS P ÜS P ÜS P ÜS P 95 72 55 43 34 H H hAgo2 C DNaseI & Triton Wasch 1 Wasch 2Wasch 3 kDa Lysat ÜS P ÜS P ÜS P ÜS P 95 72 55 43 34 resolubilisert ÜS P rückgefaltet ÜS P resolubilisert ÜS P rückgefaltet ÜS P resolubilisert ÜS P rückgefaltet ÜS P Abbildung 5.6: Präparation verschiedener hAgo2-Fusionsproteine aus inclusion bodies (siehe Abschnitt 4.3.8). (A) Western-Analyse von NHA-hAgo2 mittels α-HA-Antikörper. (B) Western-Analyse von hAgo2-His mittels α-hAgo2-Antikörper. (C) Detektion von His-hAgo2 durch Coomassie-Färbung. Die Banden vollständig translatierter Zielproteine sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. ÜS: Überstand nach Zentrifugation. P: Sediment nach Zentrifugation. 94
5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP Reinigung mittels Anitätschromatographie unter nicht-denaturierenden Bedingungen Für die beiden Konstrukte His-hAgo2 und hAgo2-His ergab sich die Möglichkeit einer anitätschromatographischen Reinigung. Zwar lag nur ein geringer Proteinanteil von ca. 10 % in gelöster Form vor (siehe Abbildung 5.2), jedoch wurde aus den bereits genannten Gründen für eine Reinigung unter nicht-denaturierenden Bedingungen zunächst diese Strategie verfolgt. Die Untersuchungen wurden mit hAgo2-His durchgeführt und sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst. Die Integrität <strong>der</strong> Ni 2+ -NTA-Säulenmatrix wurde getestet, indem ein GST-His- Fusionsprotein nach Herstellerangaben erfolgreich gereinigt wurde. Zellaufschluss Elution Säulenmaterial Maÿstab 50 mM Tris pH 7,4 linear 5 500 mM Imidazol 1,5 ml Ni 2+ -NTA präparativ 0,5 mM DTT in 100 min 1 mM PMSF 40 ml pro 14 g Zellen 50 mM Tris pH 7,4 linear 0 500 mM Imidazol 1,5 ml Ni 2+ -NTA präparativ 40 ml pro 14 g Zellen in 100 min 50 mM Tris pH 7,4 150 mM Imidazol 150 µl TALON analytisch 0,5 mM DTT 1 mM PMSF 151 µl pro 50 mg Zellen 50 mM Tris pH 7,4 pH 4,4 150 µl TALON analytisch 0,5 mM DTT 1 mM PMSF 151 µl pro 50 mg Zellen Tabelle 5.1: Getestete Bedingungen für die nicht-denaturierende Reinigung von hAgo2-His. Bei den untersuchten experimentellen Bedingungen zeigte sich, dass sowohl die Bindung von hAgo2-His an das Säulenmaterial als auch die Elution des Proteins problematisch waren, was zu sehr geringen Ausbeuten führte. Deshalb wurde die Reinigungsstrategie geän<strong>der</strong>t, um den wesentlich gröÿeren unlöslichen Proteinanteil unter denaturierenden Bedingungen zu isolieren. Reinigung mittels Anitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen Für die systematische Entwicklung eines Protokolls wurde zunächst die Bindung von hAgo2- His an die Säulenmatrix und im Anschluss die Elution des Zielproteins untersucht. Dabei 95
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Aus dem Institut für Molekulare Me
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
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4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse
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5.12 Untersuchung des Einusses von
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1 Zusammenfassung Die RNA-Interfere
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Summary RNA interference (RNAi) is
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2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.3 Die Familie der Argonaute Prote
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2.4 Die strukturellen und molekular
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2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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2.7 Ziel dieser Arbeit der Freisetz
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3 Material Deutschland), Roche (Bas
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3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
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3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
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3 Material Coomassie-Entfärbelösu
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Seite 58 und 59: 3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
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Seite 88 und 89: 4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
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6.5 Modell der minimalen rekombinan
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6.6 Ausblick einer konformationelle
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