Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
5'-Endmarkierung wurde unter RNase-freien Bedingungen durchgeführt.
Es wurden 10 pmol Nukleinsäure in 1 × PNK-Puer A mit 1 u/µl RiboLock RNase Inhibitor,
10 pmol [γ- 32 P]-ATP (6000 Ci/mmol) und 0,5 u/µl T4 PNK für 1 h bei 37 ◦ C und anschlieÿend
für 10 min bei 75 ◦ C inkubiert. Das nicht inkorporierte ATP wurde durch Gelltration
mit einer Sephadex-G-50 Säule nach Herstellerangaben abgetrennt. Die radioaktiv markierte
target RNA wurde in 400 µl H 2 O eluiert und die Ezienz der Reaktion mittels Messung der
Flüssigszintillation im β-Zähler in Dreifachbestimmung ermittelt.
4.2.7 Herstellung radioaktiver Nukleinsäure-Gröÿenmarker
Für die Abschätzung der Gröÿen von Nukleinsäure-Banden wurde auf Sequenziergelen (siehe
Abschnitt 4.1.3) ein radioaktiver Gröÿenmarker aufgetragen, der durch den Verdau einer
radioaktiv 5'-endmarkierten target RNA (siehe Abschnitt 4.2.6) durch RNase T1 hergestellt
wurde. Bei dem Enzym RNase T1 handelt es sich um eine Endonuklease, die die Spaltung
einzelsträngiger RNA auf der 3'-Seite von Guanin-Nukleotiden katalysiert.
200 fmol der radioaktiv markierten target RNA wurden mit 1 µg nicht markierter RNA
versetzt, deren Überschuss eine quantitative Spaltung der target RNA verhindert. Die Nukleinsäure
wurde für 1 h in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 9 µl RSB-Puer (siehe
Abschnitt 3.6) aufgenommen. Es folgte die Spaltung mit 1 100 u/µl RNase T1 für 15 min
bei 50 ◦ C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ladepuer für denaturierende PAA-Gele
gestoppt. Tabelle 4.7 gibt die Länge der radioaktiven Spaltprodukte an.
Länge der Spaltprodukte (nt)
ICAM-1-IVT
s2B
140 89 21
138 85 11
137 79 7
135 78 1
133 75
119 70
113 69
110 68
109 60
107 57
103 54
Tabelle 4.7: Länge der Banden der radioaktiven Nukleinsäure-Gröÿenmarker.
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