Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
Konstrukte wurden mit dem linearisierten pET41b(+)_modiziert ligiert und die Plasmide
pET41b(+)-GST-hAgo2-His und pET41b(+)-GST-hAgo2 (siehe Abbildung 5.3 B und C)
wurden mittels Elektroporation in den E. coli Stamm BL21(DE3) eingebracht. Nach Anzucht
unter Kanamycin-Selektion folgte die Untersuchung von Kolonien mittels PCR sowie
die Plasmid-Isolierung mit anschlieÿender Restriktionsanalyse. Plasmide aus erfolgreich transformierten
Kolonien wurden zum Ausschluss von Mutationen sequenziert und je ein Stamm
für die weiteren Arbeiten ausgewählt.
5.3.3 Studien zur Optimierung der Expression von GST-hAgo2 und
GST-hAgo2-His
Nachdem sichergestellt wurde, dass die beiden Stämme GST-hAgo2-His bzw. GST-hAgo2
exprimierten, wurden mit dem Ziel der Gewinnung einer gröÿtmöglichen Menge an gelöstem
Protein die Bedingungen für die Expression optimiert. Hierzu wurden die Temperatur während
der Induktion, ihre Dauer sowie die Zusammensetzung des Bakterienkulturmediums variiert.
Zunächst wurden die Bakterienstämme in LB-Medium bei 37 ◦ C kultiviert und die Expression
der Proteine für 6 h induziert. Eine zeitaufgelöste Analyse der fraktionierten Zellextrakte
zeigte, dass bei beiden Stämmen nach 2 h der gröÿtmögliche Anteil an gelöstem Protein vorlag;
längere Induktionszeiten führten zu einer Verschiebung hin zu mehr ungelöstem Protein. Das
Experiment wurde bei 17 ◦ C und 29 ◦ C wiederholt, wobei bei 17 ◦ C auch mit einer Ausdehnung
der Induktionszeit auf 18 h keine Proteinexpression beobachtet werden konnte. Die bei
29 ◦ C kultivierten Bakterien exprimierten zwar nach 2 h einen vergleichbaren Anteil an Protein
wie bei 37 ◦ C, allerdings lag ein geringerer Anteil in gelöster Form vor. Um den Einuss des
Kulturmediums auf Bakterienwachstum und Proteinexpression zu untersuchen, wurden beide
Stämme in dem nährstoreicheren und gepuerten TFB-Medium kultiviert. Das Medium hatte
auf die Proteinmenge pro Bakterienzelle keinen Einuss, allerdings wurde das Zellwachstum
nach IPTG-Zugabe im Vergleich zur Anzucht in LB-Medium verstärkt, was also insgesamt zu
einer höheren Proteinausbeute führte. Somit wurden als optimale Bedingungen für die Expression
von GST-hAgo2-His und GST-hAgo2 die Bakterienstämme in TFB-Medium kultiviert
und die Proteinexpression bei 37 ◦ C für 2 h induziert (siehe Abbildung 5.4).
Die Identität von hAgo2 sowie die Integrität der Markierungen wurden durch Western-
Analysen unter Verwendung von adäquaten Antikörpern und Gröÿenmarkern nachgewiesen
(siehe Abbildung 5.4 B, D). Gleichzeitig zeigte sich, dass durch das Anfügen der GST-Markierung
zwar die Löslichkeit von hAgo2 erhöht, jedoch die Translationsezienz nicht verbessert
werden konnte. Eine Erniedrigung der Induktionstemperatur auf 17 ◦ C führte ebenfalls zu
keiner Verbesserung der Translationsezienz. Wie bereits unter Abschnitt 5.3.1 beschrieben,
weist die Detektion von vollständig translatierten Proteinen allein im Vergleich zur zusätzlichen
Detektion C-terminal verkürzter Varianten (siehe Abbildung 5.4 D) auf eine hohe Anzahl
unvollständig translatierter Versionen von hAgo2 hin.
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