Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.4 Die strukturellen und molekularen Grundlagen der siRNA-vermittelten RNAi
strukturen des T. thermophilus Ago im Komplex mit verschiedenen Nukleinsäuren geben nun
detaillierten Einblick in die strukturellen Voraussetzungen für die molekulare Dynamik eines
Argonaute Proteins an Schlüsselstellen der siRNA-vermittelten RNAi [153].
Das Apo-Enzym wird am ehesten durch T. thermophilus Ago repräsentiert, das an einen
10-mer guide Strang gebunden vorliegt, da eine Röntgenstruktur von T. thermophilus Ago in
Abwesenheit einer Nukleinsäure nicht existiert (siehe Abbildung 2.8 A) [28].
Der binäre Komplex entspricht dem mit einer 21 nt langen guide DNA komplexierten Protein
(siehe Abbildung 2.8 B). Apo-Enzym und binärer Komplex unterscheiden sich in ihrer
Konformation, wie die Überlagerung beider Komplexe zeigt. Im Verhältnis zur PIWI Domäne
kommt es auf Grund der guide Strang-Bindung zu einer Rotation der Mid Domäne um 22 ◦ ,
was zu einer Verlängerung der basischen Bindungsfurche zwischen den beiden Lappen um 8 Å
führt. Weiterhin dreht sich die PAZ Domäne relativ zur PIWI Domäne um 25 ◦ und verengt
dadurch die Bindungsfurche, resultierend in einem festen Kontakt zur guide DNA, die für
eine target RNA-Interaktion ausgerichtet ist. Unerwarteterweise führt die räumliche Ausrichtung
von R548 dazu, dass sich die 10. und 11. Base der guide DNA orthogonal anordnen.
Für eine korrekte Positionierung der target RNA muss also zuvor eine konformationelle Änderung
durchlaufen werden, um die räumliche Nähe des zu spaltenden Phosphates zum aktiven
Zentrum zu gewährleisten [28].
Der ternäre Komplex wird durch drei molekulare Bilder beschrieben [153]. Im ersten Fall
liegt der binäre Komplex an eine 12 nt lange target RNA gebunden vor. Der Komplex beschreibt
den Prozess der target RNA-Erkennung, bei dem zunächst Watson-Crick-Basenpaarungen
im seed Bereich gebildet werden (siehe Abbildung 2.8 C). Beim Übergang vom binären
zum im seed Bereich gepaarten ternären Komplex kommt es zu einer konformationellen Änderung
des Proteins, bei dem R548 verlagert wird. Gleichzeitig verschiebt sich der die N-terminale
und PAZ Domäne enthaltende Lappen für eine Önung der basischen Bindungsfurche. Somit
wird eine lineare Ausrichtung der guide DNA und die eektive Bindung der target RNA ermöglicht.
Im zweiten Fall beinhaltet der ternäre Komplex ein 15-mer, repräsentativ für die
folgende Hybridisierung zwischen guide und target über den seed Bereich hinaus (siehe Abbildung
2.8 D). Die Ausbildung dreier zusätzlicher Basenpaare führt zu einer Rotation der PAZ
Domäne und der Erweiterung der Bindungsfurche zwischen N-terminaler und PIWI Domäne,
was durch konformationelle Änderungen von Bereichen der PIWI Domäne stabilisiert wird.
Gleichzeitig kann das 3'-Ende der guide DNA seine Bindetasche in der PAZ Domäne nicht länger
erreichen und wird aus dieser entlassen. Das dritte molekulare Bild, ein 19-mer als target
RNA im ternären Komplex, repräsentiert den katalytisch kompetenten Status (siehe Abbildung
2.8 E). Beim Übergang zu diesem Komplex kommt es nur zu geringen konformationellen
Änderungen [120].
Die strukturellen Daten unterstützen das ursprünglich von Tomari und Zamore postulierte
two state Modell, nach dem das 3'-Ende des guide Stranges während des RNAi-Zyklus dyna-
23