Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Ansätzen zum Reaktionsstart erfolgte. Die Experimente wurden in auf das jeweilige Protein
abgestimmten Puern durchgeführt, die zuvor durch einen Filter mit 0,2 µm Porengröÿe
ltriert und entweder im Ultraschallbad oder durch Anlegen eines Vakuums für etwa 15 min
entgast worden waren (siehe Tabelle 4.14).
Protein
Puer
hAgo2
Ago2-Bindungspuer (1 ×)
Ago2-Spaltungspuer (1 ×)
hTRBP TRBP-Puer (1 ×)
Tabelle 4.14: Funktionell untersuchte Proteine mit zugehörigen Puern.
4.4.1 siRNA-vermittelte Spaltung von target RNA
Standard-Spaltungsassay
Die siRNA-vermittelte Spaltung von target RNA (Spaltungsassay) diente dem Nachweis der
enzymatischen Aktivität von hAgo2 (siehe Abschnitt 5.5.2). Dabei wurden die minimal benötigten
Komponenten des RISC (hAgo2, guide RNA und target RNA) miteinander inkubiert
und die sequenzspezische Spaltung der target RNA als Maÿ für die Aktivität von hAgo2
herangezogen. Als Substrat diente das 140 nt lange, am 5'-Ende radioaktiv markierte ICAM-
1-IVT, das die Erkennungssequenz für si2B trägt, also von Position 79 97 perfekt komplementär
zum guide Strang as2B ist oder die zum guide Strang komplementäre 21 nt lange RNA
s2B mit radioaktiver 5'-Endmarkierung (siehe Abschnitte 3.8.3, 4.2.3 und 4.2.6). Als Negativkontrolle
wurde der guide Strang der siLam, einer gegen Lamin A/C gerichteten siRNA,
verwendet bzw. die Reaktion ohne guide Strang durchgeführt. Die entsprechende guide RNA
wurde zuvor am 5'-Ende phosphoryliert (siehe Abschnitt 4.2.6).
In einem Standardansatz wurden 100 nM guide RNA und 2,5 nM target RNA mit verschiedenen
Konzentrationen hAgo2, die sich aus den Proteinpräparationen ergaben, bei 37 ◦ C bis
zu 2 h inkubiert. Das Experiment wurde in 1 × Ago2-Spaltungspuer in Anwesenheit von
1 u/µl RiboLock TM RNase Inhibitor zur Inhibition kompetierender RNasen durchgeführt. Die
Reaktion wurde zu angegebenen Zeitpunkten durch Zugabe von 1 Volumen Ladepuer für
denaturierende PAA-Gele sowie Einfrieren in üssigem N 2 gestoppt. Nach Denaturierung für
3 min bei 95 ◦ C folgte die Auftrennung der Ansätze mit Hilfe von denaturierenden Sequenziergelen
(siehe Abschnitt 4.1.3) unter Zuhilfenahme eines radioaktiven Gröÿenmarkers (siehe
Abschnitt 4.2.7) und die Visualisierung mittels Autoradiographie (siehe Abschnitt 4.1.4). Die
Quantizierung der Banden wurde mit dem Programm Image Quant 5.2 durchgeführt und
der Umsatz der target RNA wie folgt berechnet:
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