Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
% Umsatz
5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2
A
NHA hAgo2
hAgo2 H
B
- + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + +
- - - - - - + + + + K
NHA-hAgo2
target RNA
guide RNA
- + + + + + + +
+ + + + + + + +
- + + + + + K -
hAgo2-His
target RNA
guide RNA
t (min)
t (min)
IVT (140 nt)
IVT (140 nt)
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
C
D
100
GST
- + + + + +
+ + + + + +
- + + + + -
hAgo2
GST-hAgo2
target RNA
guide RNA
t (min)
100
IVT (140 nt)
80
60
80
60
40
20
0
0 2000 4000 6000 8000
Zeit (s)
Konstrukt max. Umsatz (%) k gesamt (s -1 )
40
5’-Spaltprodukt
20
(87 nt)
GST-hAgo2 91,9 (± 2,9) 0,0004 (± 0,00004)
NHA--hAgo2 NHA-hAgo2 83,5 (± 5,5) 0,0003 (± 0,00005)
hAgo2-His 12,0 (± 6,9) 0,0002 (± 0,0002)
Abbildung 5.12: Nachweis der 0 Spaltungsaktivität von rekombinantem hAgo2 (siehe Abschnitt 4.4.1).
0 2000 4000 6000 8000
Standard-Spaltungsassay mit 2,4 µM NHA-hAgo2 (A), 2,2 µM hAgo2-His (B) oder 3,7 µM GST-hAgo2
Zeit (s)
(C) mit anschlieÿender denaturierender PAGE und Detektion mittels Autoradiographie. (D) Bestimmung
von maximalem Umsatz und Geschwindigkeit der Spaltungsreaktion durch die verschiedenen
hAgo2-Konstrukte. Der Umsatz wurde gegen die Zeit aufgetragen und die korrespondierende Ratenkonstante
k gesamt durch Anpassung der experimentellen Daten an eine exponentielle Gleichung ermittelt.
K: Kontroll-Ansatz mit asLam als guide RNA. t: Zeit. IVT: ICAM-1 in vitro Transkript als target
RNA.
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