Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.12 Untersuchung des Einusses von hTRBP auf die siRNA-vermittelte target
RNA-Spaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
6 Diskussion 165
6.1 Untersuchung der siRNA-vermittelten RNAi mit Hilfe von rekombinanten Komponenten
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
6.2 Stabilität von rekombinantem hAgo2 und hTRBP . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
6.2.1 Der Oligomerisierungszustand von hAgo2 wird durch RNAs beeinusst . 169
6.2.2 Der Oligomerisierungszustand von hTRBP ist RNA-unabhängig . . . . . 170
6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2 . 171
6.3.1 Die Beladung von hAgo2 mit siRNA ist abhängig von der Beschaenheit
des 5'-Endes des guide Stranges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
6.3.2 Die Erkennung und Bindung der target RNA erfolgt durch Wechselwirkungen
mit der guide RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
6.3.3 hAgo2 besitzt siRNA-Strangtrennungs- und target RNA-Spaltungsaktivität
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
6.3.4 Die Freisetzung der Spaltprodukte limitiert die Geschwindigkeit der Reaktion
bei multiplem Umsatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
6.3.5 Minimales kinetisches Modell der Wirkungsweise von hAgo2 . . . . . . . 188
6.4 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP . . . . . . . . . . . . . . . 189
6.4.1 hTRBP bindet siRNA mit hoher Anität . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
6.4.2 Die Bindung von siRNA durch hTRBP beruht auf einer schnellen konformationellen
Umlagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
6.4.3 Die dsRNA-bindenden Proteine hTRBP und hPACT besitzen vermutlich
einen entgegengesetzten Einuss auf die siRNA-vermittelte target
RNA-Spaltung durch hAgo2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
6.5 Modell der minimalen rekombinanten RNA-Interferenz . . . . . . . . . . . . . . 193
6.6 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
7 Literaturverzeichnis 197
A Anhang 223
A.1 Theoretische Grundlagen der biochemischen und biophysikalischen Methoden . 223
A.1.1 Ermittlung von Dissoziationskonstanten durch Fluoreszenztitration
unter steady state Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
A.1.2 Ermittlung von Dissoziationskonstanten durch Verdrängungstitration
unter steady state Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
A.1.3 Ermittlung von Molekülgröÿen durch Dynamische Lichtstreuung . . . . 225
A.2 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
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