Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Mass (%)
Mass (%)
5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2
NHA
hAgo2
A
60
50
60
B
1 2
50
40
30
40
30
3
20
20
10
0
0,1 1 10 100 1000
Population
R h
(nm)
Rh (nm)
Pd
(%)
MW-R
(kDa)
Mass
(%)
1 8,7 24,8 531 99,8
2 30,9 0,0 10302 0,2
2
10
0
0,1 1 10 100 1000
Population
R h
(nm)
Rh (nm)
Pd
(%)
MW-R
(kDa)
Mass
(%)
2 53,1 6,3 36652 55,8
3 314,4 13,1 2348440 44,2
Abbildung 5.16: Regularisierungs-Histogramm der Dynamischen Lichtstreuung isolierter Populationen
von NHA-hAgo (siehe Abschnitt 4.4.5). Überstand (A) und resuspendiertes Sediment (B) nach
Zentrifugation einer 24,1 µM Lösung NHA-hAgo2 in Rückfaltungspuer. Die Messung wurde bei 25 ◦ C
durchgeführt. Die unterschiedliche Breite der Balken im Histogramm erklärt sich durch die logarithmische
Abszissenachse. Mass: Massenanteil. R h : hydrodynamischer Radius. Pd: Polydispersität. MW-R:
auf Grundlage von R h berechnetes Molekulargewicht.
Bei Verdünnung von NHA-hAgo2 in Ago2-Spaltungspuer war ebenfalls die Bildung groÿer
Aggregate in einem Zeitraum von wenigen Minuten beobachtbar. Diese Erkenntnis warf die
Frage auf, inwieweit es während der Durchführung eines Spaltungsassays zur Aggregation und
damit eventuell zur Inaktivierung von hAgo2 kommt. Deshalb wurde zunächst die Thermostabilität
von NHA-hAgo2 untersucht. Hierfür wurde eine Proteinlösung in Rückfaltungspuffer
schrittweise erwärmt und die Zunahme der durchschnittlichen Radien aller Populationen
beobachtet (siehe Abbildung 5.17 A). Es zeigte sich, dass die Zusammensetzung der hAgo2-
Populationen über einen Temperaturbereich von 4 30 ◦ C stabil ist; darüber hinaus kommt es
zu einer Zunahme der durchschnittlichen Radien um ca. das Zweifache bei 50 ◦ C. Dies deutet
auf eine temperaturinduzierbare Proteinaggregation hin.
Im nächsten Schritt erfolgte die Inkubation von NHA-hAgo2 mit guide RNA und nichtradioaktiv
markierter target RNA, analog zu einem Standard-Spaltungsassay, bei 4 ◦ C, 25 ◦ C
und 37 ◦ C. Die Dynamische Lichtstreuung wurde zu den Zeitpunkten 0 min, 10 min, 30 min,
60 min und 120 min aufgezeichnet (siehe Abbildung 5.17 B). Während es bei 4 ◦ C und 25 ◦ C
über die Zeit zu keiner wesentlichen Veränderung der durchschnittlichen Radiengröÿe kam,
konnte bei der Inkubation aller essentiellen Spaltungsassaykomponenten bei 37 ◦ C eine zeitabhängige
Zunahme verzeichnet werden.
Die Regularisierungs-Histogramme zeigten bei allen drei Temperaturen eine Verschiebung
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