Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
4.3.2 Fällung von Proteinen
Ammoniumsulfat-Fällung
Ammoniumsulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) ist ein kosmotropes Salz, das hydrophobe Eekte in Proteinlösungen
vergröÿert und somit Proteinaggregation über hydrophobe Wechselwirkungen fördert.
Dabei schützt es in hohen Konzentrationen die biologische Aktivität, führt also nicht zu Denaturierung.
Eine Lösung mit dem zu fällenden Protein wurde bei 4 ◦ C unter Rühren bis zu einer Sättigung
von 60 % mit (NH 4 ) 2 SO 4 versetzt und für 1 24 h rührend bei 4 ◦ C inkubiert. Das
Präzipitat wurde durch eine Zentrifugation bei 50.000 × g und 4 ◦ C für 30 min sedimentiert
und in gewünschtem Volumen und Puer gelöst.
Trichloressigsäure-Fällung
Bei der Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) handelt es sich um eine eziente, quantitative
Präzipitationsmethode. Es kommt zu einer irreversiblen Denaturierung von Proteinen, weshalb
diese Art der Fällung nur angewendet wurde, wenn die biologische Aktivität der Proteine für
weitere Anwendungen nicht mehr benötigt wurde, z. B. bei der SDS-PAGE (siehe 4.3.3).
Eine Lösung mit dem zu fällenden Protein wurde bei 4 ◦ C auf eine nale Konzentration von
10 % TCA (w/v) eingestellt und für 1 24 h auf Eis inkubiert. Das Präzipitat wurde durch eine
Zentrifugation bei 20.000 × g und 4 ◦ C für 20 min sedimentiert und in gewünschtem Volumen
und Puer gelöst.
4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse von Proteinen
Für die elektrophoretische Separation von Proteinen wurde die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) nach Laemmli [254] angewendet. Bei dieser Methode
werden Proteine durch Hitze und DTT oder β-Mercaptoethanol denaturiert und durch
SDS umhüllt, da es an hydrophobe Regionen der Proteine bindet. So weisen alle Proteine eine
negative Nettoladung und eine ellipsoide Form auf, weshalb sie sich im elektrischen Feld ausschlieÿlich
auf Grund ihrer Gröÿe unterschiedlich schnell durch ein PAA-Gel bewegen. Durch
Verwendung eines adäquaten Gröÿenmarkers (siehe Abschnitt 3.10) kann einzelnen Proteinbanden
ein Molekulargewicht zugeordnet werden.
Die Proben wurden mit Ladepuer für SDS-PAGE (siehe Abschnitt 3.6) eingestellt und vor
dem Probenauftrag für 3 min bei 95 ◦ C denaturiert. Als Laufpuer diente 1× Elektrophoresepuer
für SDS-PAGE (siehe Abschnitt 3.6).
Die SDS-PAGE erfolgte in einer vertikalen Gelkammer mit 85 × 100 × 0,75 mm groÿen Gelen
bei 1,7 mA/cm Gellänge für 90 120 min. Die Gele bestanden aus einem 5 %igen Sammelgel
und einem Trenngel, dessen Prozentigkeit sich nach dem Molekulargewicht der aufzutrennenden
Proteine richtete (siehe Tabelle 4.8).
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