Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.6 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hTRBP
ner Zunahme der durchschnittlichen Radien kommt. Daher sind enzymatisch aktive Komplexe
scheinbar besser vor Aggregation geschützt als nicht aktive Komplexe.
In einem letzten Satz von Experimenten wurde die Bildung von Aggregaten in Standard-
Spaltungsassay-Ansätzen bzw. in verschiedenen Kontrollen durch die Erhöhung der Temperatur
induziert und die Zunahme der durchschnittlichen Radien beobachtet (siehe Abbildung
5.17 D). Wie bereits zuvor gezeigt, kam es zur Aggregatbildung in einem Kontrollansatz, der
nur NHA-hAgo2 enthielt. Anders als bei einer konstanten Temperatur werden aktive Komplexe
nicht vor Aggregation geschützt; die Zunahme der durchschnittlichen Radien erfolgte
beim Ansatz mit as2B und ICAM-1-IVT etwa im gleichen Maÿ wie bei den Kontrollen ohne
guide RNA bzw. der nicht-komplementären guide RNA asLam. Allerdings führte die Anwesenheit
der target RNA allein zu einem fast vollständigen Schutz vor temperaturinduzierter
Aggregation von NHA-hAgo2.
5.6 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem
hTRBP 4
5.6.1 Untersuchung der Präparation auf Nuklease-Verunreinigungen und
proteingebundene Nukleinsäuren
Beide hTRBP-His-Präparationen wurden auf eine mögliche Kontamination mit Nukleasen getestet
(siehe Abschnitt 4.3.10). Es zeigte sich, dass bei der ersten Präparation eine leichte
Kontamination vorhanden war, die sich bei niedrigen Proteinkonzentrationen jedoch nicht
bemerkbar machte. Das bei dieser Reinigung gewonnene hTRBP-His wurde für die Charakterisierung
der Nukleinsäurebindung durch Gelverzögerungs-Analysen sowie Studien zum Oligomerisierungsverhalten
von hTRBP verwendet. Die zweite Präparation wies eine stärkere
RNase-Kontamination auf. Protein dieser Reinigung wurde für Experimente eingesetzt, deren
Dauer so kurz war, dass die Kontamination vernachlässigbar war. In jedem Fall wurden
Inkubationszeiten so kurz wie möglich gehalten sowie bei Bedarf die Experimente unter Verwendung
von RNase-Inhibitoren durchgeführt.
Da hTRBP die Fähigkeit besitzt, Nukleinsäuren zu binden, sollte weiterhin ausgeschlossen
werden, dass das bakteriell exprimierte hTRBP-His an Nukleinsäuren gebunden vorlag, die
bei der Reinigung unter nicht-denaturierenden Bedingungen nicht entfernt worden waren. Das
Verhältnis der Absorption A 260 nm /A 280 nm zeigte kein eindeutiges Ergebnis bezüglich einer
Nukleinsäurekontamination, da hTRBP-His ein unüblich kleines Absorptionsmaximum von
weniger als 270 nm besitzt. Deshalb wurde das gereinigte hTRBP-His mittels denaturierender
12 % SDS-PAGE analysiert. Die Detektion erfolgte in drei Alternativen: mittels Coomassie-
Färbung können ausschlieÿlich Proteine, durch Silbernitrat-Färbung Proteine sowie Nuklein-
4 Die in Abschnitt 5.6 beschriebenen Experimente wurden in Zusammenarbeit mit J. Blank im Rahmen der
Betreuung ihrer Bachelorarbeit durchgeführt.
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