Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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konnte mit der bisher verwendeten Matrix Ni 2+ -NTA weder unter nicht-denaturierenden noch
unter denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von 2 M Harnsto eine zufriedenstellende
Bindung erzielt werden. Deshalb wurde im Folgenden eine Matrix mit immobilisierten Co 2+ -
Ionen (TALON Superow) verwendet.
Für die Optimierung von Proteinbindung bei der Beladung der Matrix sowie der Elution
wurden die Puerbedingungen und der pH-Wert, die Art, Dauer und Temperatur während
der Beladung und Elution wie folgt variiert.
Für die Optimierung der Proteinbindung bei der Beladung der Matrix wurden zunächst
im analytischen Maÿstab die Puerbedingungen variiert. Es wurden 20 50 mg Bakterienzellen
in 1 ml nicht-denaturierendem Puer lysiert und nach Entfernen der gelösten bakteriellen
Proteine durch Zentrifugation der verbliebene unlösliche Anteil in verschiedenen Puern
bei pH 12 solubilisiert. Die gewonnene Lösung wurde mit 125 µl Säulenmatrix für 1 h bei
4 ◦ C unter ständiger Bewegung inkubiert. Es wurde der Einuss von Harnsto, NaOH, NaCl,
β-Mercaptoethanol und den Puersubstanzen Na 2 HPO 4 bzw. CAPS untersucht, wobei die
Verwendung eines Puers mit 2 M Harnsto und 20 mM CAPS als einziger ein positives Ergebnis
zeigte. Eine Behandlung der Zellen bei Raumtemperatur gegenüber bei 4 ◦ C zeigte
keinen Unterschied. Im Weiteren wurden 2 g Bakterienzellen in 20 ml denaturierendem Puer
bei pH 8 in Anwesenheit von 8 M Harnsto und 5 mM β-Mercaptoethanol lysiert. Unlösliche
Bestandteile wurden durch Zentrifugation für 15 min bei 4 ◦ C und 50.000 × g entfernt und
der verbliebene Anteil mit 125 µl Säulenmatrix für 16 h bei 4 ◦ C unter ständiger Bewegung
inkubiert. Eine anschlieÿende Western-Analyse und Quantizierung zeigte, dass durch dieses
Verfahren ca. 30 % hAgo2-His an die Säulenmatrix gebunden werden konnte.
Im Anschluss wurde nach optimalen Bedingungen für die Elution gesucht. Zunächst wurde
eine Elution von Proteinen untersucht, die unter Verwendung von 2 M Harnsto mit der
Säulenmatrix inkubiert worden waren. Die Erniedrigung des pH-Werts von 12 während der
Beladung auf 5,5 während der Elution zeigte keinen Erfolg. Auch eine Elution durch Verdrängung
mit Imidazol brachte nur eine geringe Ausbeute. Der Einuss verschiedener Imidazolund
Harnsto-Konzentrationen sowie von L-Arginin-Zusatz wurde getestet, führte aber ebenfalls
nicht zu einem verbesserten Ergebnis. Das Protein, das in Anwesenheit von 8 M Harnsto
an die Säulenmatrix gebunden hatte, konnte durch Erniedrigung des pH-Werts auf 4,5 in Anwesenheit
von 1 mM β-Mercaptoethanol eluiert werden.
Da sich sowohl die Bindung von hAgo2-His an die Säulenmatrix als auch die Elution unter
denaturierenden Bedingungen als problematisch erwiesen, wurde zur Gewinnung einer möglichst
groÿen Proteinmenge eine groÿe Bakterienzellmasse eingesetzt und die Reinigung unter
Zuhilfenahme einer FPLC-Anlage im präparativen Maÿstab mit den bisher genutzten Bedingungen
durchgeführt. Allerdings konnten diese Bedingungen nicht erfolgreich vom analytischen
auf einen präparativen Maÿstab übertragen werden. Aus technischen Gründen erfolgte im präparativen
Maÿstab die Beladung der Säulenmatrix mit Hilfe einer Pumpe ohne permanente
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