Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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mit unterschiedlichen Ratenkonstanten durchlaufen werden müssen. Dabei ist es unerheblich,
ob der guide Strang an seinem 5'-Ende eine Phosphatgruppe trägt.
Für beide Substrate konnte für die jeweils erste schnelle Phase (siehe Abbildung 5.26 A und
C, Darstellung bis 1 s) eine Ratenkonstante pseudo-erster Ordnung (k 1, obs ) ermittelt werden.
Eine Auftragung der Ratenkonstanten gegen die Proteinkonzentration ergab einen linearen
Zusammenhang (siehe Abbildung 5.26 B und D). Aus der Steigung der Geraden wurde die
Assoziationsratenkonstante der ersten Phase mit k 1 = 0,6 (± 0,001) × 10 8 M -1 s -1 für den Komplex
aus NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM sowie k 1 = 0,6 (± 0,05) × 10 8 M -1 s -1 für den Komplex
aus NHA-hAgo2 und OH-as2B-FAM ermittelt. Da die Assoziationsratenkonstante der ersten
Phase konzentrationsabhängig ist, repräsentiert sie sehr wahrscheinlich die diusionskontrollierte
Bildung eines Kollisionskomplexes. Die Bestimmung der Dissoziationsratenkonstante der
ersten Phase erfolgte aus dem Ordinatenabschnitt und ergab k -1 = 6,2 (± 0,62) s -1 für den Komplex
aus NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM und k -1 = 5,5 (± 3,3) s -1 für den Komplex aus NHAhAgo2
und OH-as2B-FAM. Dabei muss allerdings bedacht werden, dass solcherart bestimmte
Dissoziationsratenkonstanten oft fehlerbehaftet sind, da sich bereits geringe Abweichungen bei
den experimentell bestimmten Raten pseudo-erster Ordnung stark auf den Ordinatenabschnitt
auswirken.
Auch für die beiden folgenden Phasen konnten die Ratenkonstanten gemessen werden. Beide
sind langsamer und nicht abhängig von der Proteinkonzentration. Sie betragen für den Komplex
aus NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM k 2 = 0,26 (± 0,16) s -1 und k 3 = 0,0122 (± 0,0024) s -1 .
Für den Komplex aus NHA-hAgo2 und OH-as2B-FAM wurden die Ratenkonstanten k 2 = 0,16
(± 0,07) s -1 und k 3 = 0,0104 (± 0,0018) s -1 ermittelt. Die angegebenen Ratenkonstanten stellen
Mittelwerte aus je fünf unabhängigen Experimenten dar. Die zweite und dritte Phase könnten
konformationelle Umlagerungen von hAgo2 während der Bindung des guide Stranges beschreiben,
also die Verankerung des 5'-Endes in der Mid Bindetasche und die des 3'-Endes in der
PAZ Domäne repräsentieren.
Um die Assoziationsratenkonstanten jeweils biologisch relevanten Prozessen zuordnen zu
können, wurden stopped ow Messungen mit 5'-phosphorylierten und unphosphorylierten guide
RNAs durchgeführt, die an verschiedenen Positionen mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen
waren (siehe Abbildung 5.27, aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in der Darstellung
nicht zwischen phosphoryliert und nicht-phosphoryliert unterschieden). Dabei wurde die Tatsache
ausgenutzt, dass die Fluorophore FAM und Alexa488 einen gewissen Raumbedarf haben
und deshalb mit der Bindung an hAgo2 interferieren können. Wenn bestimmte Phasen der
Komplexbildung bei Verwendung einzelner guide RNAs nicht mehr stattnden, lässt dies auf
eine Störung durch die Markierung in Abhängigkeit von deren Position schlieÿen, was Aufschluss
über die Interaktionsstelle von Protein und Nukleinsäure gibt.
Es wurden Messungen mit je 20 nM Substrat und 300 nM NHA-hAgo2 durchgeführt und
die Ratenkonstanten k 1 , k 2 und k 3 bestimmt. In allen Fällen kam es zu einer Änderung
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