Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
relative Fluoreszenz
relative Fluoreszenz
relative Fluoreszenz
5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex
3,6
GST
hAgo2
3,6
3,4
3,2
3
2,8
A
1,8
1,6
1,4
1,2
1
2,6
0 200 400 600 0,8
800 1000
Zeit (s) 0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
3,4
3,2
B
1,02
3
guide und target RNA
0,98
komplementär
2,8
guide und target RNA
nicht komplementär
0,96
2,6
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s) 0,94
1
guide und target RNA
komplementär
guide und target RNA
nicht komplementär
0,92
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Zeit (s)
Abbildung 5.34: Pre-steady state Assoziationskinetik von binärem GST-hAgo2/guide RNA-Komplex
und komplementärer bzw. nicht-komplementärer target RNA (siehe Abschnitt 4.4.3). (A) Stopped
ow Messung der Bildung des ternären Komplexes aus 20 nM P-s2B bzw. P-asGL3 sowie 600 nM GSThAgo2
und 20 nM as2B-FAM. Die Daten wurden im Fall der komplementären Stränge mit einer dreifach
exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben k 1, obs = 32,5 (± 7,4) s -1 , k 2 = 0,0110 (± 0,0003) s -1
und k 3 = 0,0030 (± 0,00002) s -1 . Im Fall der nicht-komplementären Stränge war nur die erste Phase
mit einer Ratenkonstante k 1, obs = 24,0 (± 8,9) s -1 zu beobachten. (B) Vergröÿerung der ersten 0,5 s der
Messung aus (A) zur Darstellung der ersten Phase, die sowohl bei der Verwendung komplementärer
als auch nicht-komplementärer guide und target RNA auftritt.
Untersuchung der Dissoziation von binärem Komplex und target RNA
Im nächsten Schritt wurde die Dissoziation des ternären Komplexes unter pre-steady state Bedingungen
beobachtet. Dazu wurde die target RNA durch einen 100-fachen Überschuss nichtmarkierten
Kompetitors aus dem ternären Komplex verdrängt und die Änderung des Fluoreszenzsignals
in Abhängigkeit der Zeit aufgezeichnet. Das molecular beacon (siehe Abbildung
5.31 A) war hierfür nicht geeignet, da die Zugabe eines groÿen Überschusses Kompetitor-RNA
zur Änderung des Fluoreszenzsignals führte. Somit kam es zur Überlagerung von verschiedenen
Prozessen, die eine Auswertung der Daten nicht möglich machte. Aus diesem Grund wurde
die Dissoziation ternärer Komplexe mit dem System 3 (siehe Abbildung 5.31 C) untersucht.
Zunächst wurden 600 nM GST-hAgo2 mit guide RNA für 10 min bei 25 ◦ C inkubiert, woraufhin
20 nM target RNA hinzu gegeben wurde. Die ternären Komplexe wurden rasch mit
2000 nM unmarkierter guide RNA gemischt und die zeitabhängige Signaländerung aufgezeichnet.
Für die Beobachtung schneller Ratenkonstanten wurde das Experiment mit Hilfe einer
stopped ow Anlage durchgeführt, während die Messung sehr langsamer Ratenkonstanten
durch ein Fluoreszenzspektrometer erfolgte (siehe Abbildung 5.35).
Die für den Zerfall des ternären Komplexes per dreifach exponentieller Gleichung ermittelten
Geschwindigkeitsratenkonstanten betragen k -1 = 2,1 (± 0,25) s -1 , k -2 = 0,0024 (± 0,0002) s -1
und k -3 = 0,0003 (± 0,00006) s -1 für das mittels stopped ow Anlage durchgeführte Experiment.
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