Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
5.11 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
gabe eines Überschusses nicht-markierter siLam aus dem Komplex verdrängt und die zeitabhängige
Änderung des Fluoreszenzsignals aufgezeichnet (siehe Abbildung 5.47).
Es zeigte sich, dass auch die Dissoziation mindestens ein zweiphasiger Prozess ist. Durch
Auswertung der experimentellen Daten mit einer zweifach exponentiellen Gleichung ergaben
sich k -1 = 3,2 (± 0,03) s -1 und k -2 = 0,15 (± 0,0042) s -1 für den Zerfall eines hTRBP-His/FAMsiLam-Komplexes.
Für die Rückreaktion der ersten Phase, die dem Zerfall eines Kollisionskomplexes entspricht,
konnte die bereits durch die Konzentrationsabhängigkeit der ersten Assoziationsphase ermittelte
Dissoziationskonstante k -1 (10,4 (± 2,0) s -1 ) als Orientierungshilfe dienen. Sie ist vergleichbar
mit der ersten mittels Verdrängungsexperiment ermittelten Dissoziationskonstante
k -1 = 3,2 (± 0,03) s -1 . Die Dissoziationskonstante der zweiten Phase repräsentiert demnach
wahrscheinlich eine konformationelle Umlagerung von hTRBP-His beim Zerfall des Komplexes
mit FAM-siLam. Bei der Berechnung der Dissoziationskonstante anhand von Gleichung (5.1)
ergab sich K d = 1,0 nM.
hTRBP
H
1,6
1,4
1,2
1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Zeit (s)
Abbildung 5.47: Pre-steady state Dissoziationskinetik von hTRBP-His und siRNA (siehe Abschnitt
4.4.3). Stopped ow Messung des Zerfalls von einem Komplex aus 50 nM FAM-siLam und 350 nM
hTRBP-His in Anwesenheit von 5000 nM siLam. Die Daten wurden mit einer zweifach exponentiellen
Gleichung ausgewertet und ergaben k -1 = 3,2 (± 0,03) s -1 und k -2 = 0,15 (± 0,0042) s -1 .
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