Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...
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4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen<br />
Erreichen eines optimalen Signal/Hintergrund-Verhältnisses inkubiert. Für eine folgende Immundetektion<br />
<strong>der</strong> Proteine (siehe Abschnitt 4.3.5) wurden diese mit H 2 O vollständig entfärbt.<br />
Silbernitrat-Färbung<br />
Für die Visualisierung von geringen Proteinmengen in SDS-Gelen (siehe Abschnitt 4.3.3) wurde<br />
eine Silbernitrat-Färbung durchgeführt. Bei dieser Methode werden Proteine durch Essigsäure<br />
im Gel xiert und in einer Silbernitratlösung inkubiert. Dabei lagern sich Silber-Ionen<br />
an den Proteinen an, die durch formaldehydhaltige Entwicklerlösung zu unlöslichem atomarem<br />
Silber reduziert werden. Die Proteine werden durch das braun-schwarze Silberpräzipitat<br />
angefärbt. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei ca. 1 ng Protein pro Bande.<br />
Silberfärbungen wurden mit Hilfe des Silver Stain Kits nach Herstellerangaben durchgeführt.<br />
Im Anschluss wurden Gele für 1 h bei 80 ◦ C unter Vakuum getrocknet und zu Dokumentationszwecken<br />
digitalisiert.<br />
4.3.5 Western-Analyse<br />
Neben den unspezischen Färbemethoden für Proteine (siehe Abschnitt 4.3.4) besteht die<br />
Möglichkeit <strong>der</strong> spezischen Detektion mit Hilfe von Antikörpern. Dafür werden Proteine<br />
zunächst mittels SDS-PAGE separiert (siehe Abschnitt 4.3.3) und dann durch Elektrotransfer<br />
auf eine Membran übertragen und immobilisiert. Nun können Proteine durch Immundetektion<br />
mit gegen sie gerichteten Antikörpern gezielt visualisiert werden. Die Nachweisgrenze dieser<br />
Methode hängt stark vom verwendeten Antikörper ab, ist i. d. R. jedoch weitaus sensitiver<br />
als eine Färbung mit Coomassie-Brilliantblau R 250.<br />
Elektrotransfer<br />
Für den Elektrotransfer wurde das semidry blot Verfahren angewendet. Dabei wurde eine<br />
PVDF-Membran für 2 min in 100 % (v/v) Methanol aktiviert und anschlieÿend zusammen mit<br />
dem die Proteine enthaltenden SDS-Gel für 10 15 min in 1 × Transferpuer (siehe Abschnitt<br />
3.6) equilibriert. Zusätzlich wurden sechs Lagen 3 mm starkes Filterpapier in 1 × Transferpuer<br />
getränkt und zusammen mit Gel und Membran in folgen<strong>der</strong> Anordnung in die horizontale<br />
Blotkammer gelegt:<br />
(-) Kathode<br />
drei Lagen 3 mm Filterpapier<br />
SDS-Gel<br />
PVDF-Membran<br />
drei Lagen 3 mm Filterpapier<br />
(+) Anode<br />
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