Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
nicht nötig ist. Allerdings erwies sich die Aggregationsneigung von hAgo2 als problematisch.
Reproduzierbare Ergebnisse konnten nur bei strikter Einhaltung der denierten Bedingungen
und sehr gutem Mischen von Protein und Substrat erzielt werden (siehe Abschnitt 4.4.2). Für
den Komplex aus GST-hAgo2 und P-as2B konnte eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
von 7,0 (± 0,9) nM bestimmt werden (siehe Abbildung 5.23 B). Da bei diesem Experiment der
oben beschriebene Streulichteekt durch NHA-hAgo2 nicht zum Tragen kam, konnte mittels
Filterbindung ebenfalls für den Komplex aus NHA-hAgo2 und P-as2B eine Gleichgewichts-
Dissoziationskonstante von 23,1 (± 7,9) nM ermittelt werden. Die Abweichung von dem mit
GST-hAgo2 ermittelten Wert lässt sich durch eine stärkere Aggregation erklären. Es wurde
durch eine Gelverzögerungs-Analyse zusätzlich nachgewiesen, dass durch NHA-hAgo2 P-as2B
gebunden wird (siehe Abbildung 5.23 C).
Um die biologische Relevanz der verwendeten guide RNA zu testen, wurde ein Standard-
Spaltungsassay mit P-as2B-FAM durchgeführt. Es zeigte sich, dass target RNA-Spaltung
stattfand (siehe Abbildung 5.42). Die Anwesenheit des Fluorophors führte zwar zu einem
leicht verminderten Gesamtumsatz, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei
P-as2B-FAM um eine funktionelle guide RNA handelt.
Um die Anität von hAgo2 zu einer unphosphorylierten guide RNA zu messen, wurde
eine Gleichgewichts-Fluoreszenztitration mit OH-as2B-FAM (siehe Abbildung 5.22 B) durchgeführt.
Es konnte eine Gesamtuoreszenzänderung von ca. 26 % erzielt werden. Nach Auswertung
der Titrationskurve mittels einer quadratischen Bindungsgleichung wurde eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
von 106,0 (± 7,7) nM ermittelt (siehe Abbildung 5.24).
GST
hAgo2
12000
11000
10000
9000
8000
0 500 1000 1500
GST-hAgo2 (nM)
Abbildung 5.24: Bestimmung der Anität von hAgo2 zu OH-as2B-FAM (siehe Abschnitt 4.4.2).
Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von 20 nM OH-as2B-FAM mit steigenden Konzentrationen GSThAgo2.
Die Auswertung der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab
K d = 106,0 (± 7,7) nM.
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