Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
Entlassung des guide RNA-5'-Endes aus der Mid Bindetasche kommt es zu einer Watson-Crick-
Basenpaarung des ersten Nukleotides mit dem dritten Nukleotid des passenger Stranges. Die
hierbei gewonnene Energie könnte der Grund dafür sein, warum der zweite Dissoziationsschritt
beim Zerfall eines Komplexes aus einer doppelsträngigen siRNA und NHA-hAgo2 dramatisch
schneller verläuft und auÿerdem eine Erklärung dafür liefern, warum bisher eine target RNA-
Spaltung durch mit doppelsträngiger siRNA programmiertem hAgo2 in vitro nicht gezeigt
werden konnte [35].
Bei der Berechnung der Dissoziationskonstante anhand von Gleichung (5.1) ergab sich
K d = 444 nM. Hier ndet sich erneut die bereits oben beschriebene Abweichung von dem
mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration bestimmten Wert.
5.7.4 Zusammenfassung der biochemischen und kinetischen Parameter bei
der Bildung eines binären Komplexes
Für eine vergleichende Übersicht sind die Ergebnisse zur Bindung einzel- und doppelsträngiger
siRNA durch hAgo2 an dieser Stelle tabellarisch aufgeführt.
siRNA-Substrat
K d (nM) k 1 k -1 k 2 k -2 k 3 k -3
FT FB ber. (M -1 s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 )
P-as2B-FAM 7,1 7,0 37 * 0,6 × 10 8 6,2 0,26 0,17 0,0122 0,0066
OH-as2B-FAM 106,0 n. b. 864 * 0,6 × 10 8 5,5 0,16 1,7 0,0104 0,0094
P-si2B-FAM 47,9 n. b. 444 * 1,2 × 10 8 22,0 0,48 5,7 0,0282 0,0058
Tabelle 5.2: Übersicht über die biochemischen und kinetischen Parameter bei Bildung eines binären
Komplexes. Mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration (FT) oder Filterbindungsexperiment (FB) experimentell
bestimmte oder berechnete (ber.) Dissoziationskonstanten sowie Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten
für die Bildung eines binären Komplexes aus NHA-hAgo2 und verschiedenen
siRNA-Substraten. * Für die Berechnung der Dissoziationskonstanten wurden jeweils die direkt mittels
Verdrängungsexperiment ermittelten Werte für k -1 verwendet.
5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den
binären hAgo2/guide RNA-Komplex 5
5.8.1 Etablierung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der
target RNA-Erkennung und -Bindung
Der nächste Schritt auf dem Weg zur siRNA-vermittelten Spaltung einer geeigneten target
RNA ist deren Erkennung und Bindung durch den binären Komplex aus hAgo2 und guide
RNA. Die molekularen Details dieser Bindung sind bisher nicht vollständig verstanden. Um
5 Die in Abschnitt 5.8 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit S. Willkomm im
Rahmen der Betreuung ihrer Masterarbeit durchgeführt.
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