Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
6.1 Untersuchung der siRNA-vermittelten RNAi mit Hilfe von
rekombinanten Komponenten
In dieser Arbeit wurden Erkenntnisse mit Hilfe von in vitro durchgeführten Experimenten
unter Verwendung von (semi-) artiziellen Komponenten gewonnen. Zunächst wurde mit bakteriell
exprimiertem, rekombinantem hAgo2 und hTRBP gearbeitet. Auÿerdem dienten synthetisch
hergestellte siRNAs als Substrate. Weiterhin wurden entweder synthetisch hergestellte
oder in vitro transkribierte RNAs als Modell einer target RNA verwendet. Die Verwendung
eines in vitro Modellsystems bringt mit sich, dass die experimentellen Daten sich von solchen
unterscheiden können, die innerhalb einer Zelle oder eines Organismus gewonnen wurden.
Gründe hierfür sind die nicht-physiologischen Konditionen des Puersystems, artizielle Konzentrationen
der beteiligten Komponenten, die die tatsächlichen zellulären Konzentrationen
i. d. R. um ein Vielfaches überschreiten sowie die Abwesenheit von Faktoren, die den Prozess
beeinussen können. Allerdings erlauben in vitro Systeme die gezielte Untersuchung bestimmter
Komponenten sowie die Simulation von Zuständen, wie dies in einer Zelle nicht möglich
ist.
In dieser Arbeit wurde bakteriell exprimiertes rekombinantes hAgo2 als Modellsystem für
den gesamten RISC gewählt. Diese vereinfachende Annahme wurde bereits in vorherigen Arbeiten
getroen [62, 168, 199, 200]. Dabei erfüllt das mit einer siRNA programmierte Protein
die wichtigsten Spezitäten des Komplexes. Die katalysierte Spaltung der target RNA ndet
sequenzspezisch an der kanonischen Spaltstelle gegenüber des Phosphatrückgrates zwischen
dem 10. und 11. Nukleotid des guide Stranges statt [31], wie dies auch für den RISC gezeigt
wurde. Das nicht-programmierte oder mit einer siRNA programmierte hAgo2, die keine Erkennungssequenz
innerhalb der target RNA besitzt, katalysiert auch nicht die Spaltung der angebotenen
target RNA (siehe Abschnitt 5.5.2). Wie beim RISC auch ist der target RNA-Umsatz
durch rekombinantes hAgo2 abhängig von der Mg 2+ -Konzentration im Spaltungsansatz (siehe
Abschnitt 5.5.4). Auÿerdem ist hAgo2 ebenso wie der RISC ein zum multiplen Umsatz fähiges
Enzym (siehe Abschnitt 5.9.1) [61, 62]. Die kinetischen Parameter der target RNA-Spaltung
durch hAgo2 bzw. den RISC sind vergleichbar (siehe Abschnitt 6.3.3). Aus diesen Gründen
stellt hAgo2 ein probates Modellsystem für den zellulären oder rekombinanten RISC dar.
Die Reinigung von bakteriell exprimiertem hAgo2 wird selten in der Literatur beschrieben
[62, 255]. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die Reinigung von in E. coli Zellen exprimiertem
hAgo2 problematisch ist. Zwar verspricht diese Reinigungsstrategie im Allgemeinen eine groÿe
Ausbeute, allerdings kommt es nicht zu einer posttranslationalen Modikation wie beispielsweise
einer Glykosylierung oder Phosphorylierung, was eventuell zur Instabilität des Proteins
beiträgt. Die Problematik wurde bei der Expression und Reinigung deutlich. In parallel
durchgeführten Arbeiten innerhalb der AG Dr. R. Kretschmer-Kazemi Far konnten für die
anderen humanen Ago Proteine 1, 3 und 4 ähnliche Schwierigkeiten bei der bakteriellen Ex-
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