Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP 2
Als Voraussetzung für die meisten der geplanten biochemischen Studien war eine Präparation
der Zielproteine mit möglichst hohem Reinheitsgrad sowie der Entfernung störender Faktoren
wie Nukleasen oder inhibierender Chemikalien unabdingbar. Dies stellte vor allem für
die Gewinnung von rekombinantem hAgo2 eine groÿe Hürde dar. Zwar sind bereits Reinigungsprotokolle
für bakteriell exprimiertes rekombinantes hAgo2 in der Literatur beschrieben
[62, 255], jedoch konnten mit den publizierten Strategien keine groÿen Ausbeuten erzielt werden.
Strategien wie die Isolierung aus Säuger- [79] oder Insektenzellen [199, 256] stellten auf
Grund zu geringer Ausbeuten oder der Koisolierung weiterer Proteine ebenfalls keine Alternative
dar. Aus diesen Gründen wurden, teilweise parallel, Erkenntnisse aus den verschiedenen
Reinigungsstrategien, die sich durch die Verwendung der unterschiedlichen Konstrukte (siehe
Abbildung 5.1) ergaben, gewonnen und miteinander kombiniert.
5.4.1 Studien zur Reinigung von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2
Präparation aus inclusion bodies unter denaturierenden Bedingungen
Die Überexpression von rekombinanten Proteinen führt häug zur Aggregatbildung in den
Bakterienzellen. Die Aggregate oder inclusion bodies (Einschlusskörperchen) bestehen v. a.
aus nicht nativ gefalteten Proteinen, was einen Vorteil für die Reinheit der aus den inclusion
bodies isolierten Proteinen darstellt. Der Nachteil besteht jedoch darin, dass die biologische
Funktion des Proteins durch seine Rückfaltung wiederhergestellt werden muss.
Als Basis für die Reinigung von hAgo2 unter denaturierenden Bedingungen ohne Verwendung
einer Anitätsmarkierung wurde das bereits bestehende Protokoll für NHA-hAgo2 verwendet
und auf die Konstrukte hAgo2-His und His-hAgo2 übertragen (siehe Abbildung 5.6).
Durch die Behandlung mit Lysozym, DNaseI und Detergenz wurden die Einschlusskörperchen
weitgehend von den Zelltrümmern und gelösten Bakterienproteinen getrennt. Nach
stringentem Waschen konnte das Zielprotein im Fall von NHA-hAgo2 und His-hAgo2 quantitativ
resolubilisiert werden. Die Rückfaltung erbrachte partiell gereinigtes, lösliches hAgo2,
dessen enzymatische Aktivität bestätigt werden konnte (siehe Abschnitt 5.5.2). Die Ausbeute
betrug für NHA-hAgo2 7,1 mg pro g Bakterienzellen (NI), für hAgo2-His 13,7 mg pro g
Bakterienzellen (NI) und für His-hAgo2 31,7 mg pro g Bakterienzellen (A 280 ).
2 Die in Abschnitt 5.4 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit S. Weiÿbach und
J. Blank im Rahmen der Betreuung ihrer Bachelorarbeiten sowie A. Roth im Rahmen der Betreuung ihres
studentischen Praktikums durchgeführt.
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