Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittelten RNAi
misch durch die PAZ Domäne gebunden und freigesetzt wird, während das 5'-Ende in der Mid
Domäne verankert bleibt [191]. Es erklärt die initiale Assoziation der target RNA mit dem
seed Bereich des guide Stranges im Zustand, in dem beide Enden fest gebunden sind und die
anschlieÿende Hybridisierung beider Stränge, für die freie Beweglichkeit eine Voraussetzung
ist. Abbildung 2.8 zeigt beide Zustände: im binären Komplex (B) und im das 12-mer enthaltenden
ternären Komplex (C) ist das 3'-Ende des guide Stranges verankert. In den beiden
anderen ternären Komplexen (D und E) ist das 3'-Ende nicht länger durch Ago gebunden
[153]. Bei Fehlpaarungen zwischen dem 10. und 11. Nukleotid des guide Stranges und der
target RNA wird das 3'-Ende nicht aus der PAZ Domäne entlassen (siehe Abbildung 2.2 B).
Dieser Zustand spiegelt vermutlich einen miRNA-enthaltenden RISC wider und entspricht
dem xed-end Modell [119, 153].
2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittelten RNAi
2.5.1 Die kinetische Kontrolle der RNAi
Es sind seit der Entdeckung der RNAi im Jahr 1998 unzählige Publikationen erschienen, die
das Wissen um diesen fundamentalen Genregulationsprozess vergröÿert haben wie in kaum
einem anderen Feld der Biologie. Dennoch bleibt das Verständnis des Eektorschrittes also
die Erkennung der target RNA durch einen binären Ago/guide RNA-Komplex und dessen
Spaltung mit anschlieÿender Regenerierung des binären Komplexes aus biochemischen und
kinetischen Gesichtspunkten bislang lückenhaft. Rana unterteilte vereinfachend die Beladung
und Funktion des RISC in zwei katalytisch kontrollierte Schritte mit jeweiligem Kontrollpunkt:
zum Einen die Beladung des RISC und zum Anderen die Bindung der target RNA, ihre Spaltung
und die Freisetzung der Spaltprodukte. Er schloss jedoch nicht aus, dass diese Schritte
in weitere katalytisch kontrollierte Prozesse untergliedert sein können [22].
Der erste Schritt umfasst die Beladung des RISC mit einer doppelsträngigen siRNA, gefolgt
von der Spaltung und Freisetzung des passenger Stranges, was zum Einbau des guide Stranges
in Ago führt (siehe Abbildung 2.9 A). Der zweite Schritt beinhaltet die Erkennung und Bindung
der target RNA, ihre Spaltung und die Freisetzung der Produkte (siehe Abbildung 2.9
B). In beiden Fällen bestehen die Teilprozesse aus einer Bindungsreaktion, gefolgt von einem
katalytischen Schritt, der durch die Wechselzahl k cat charakterisiert wird.
Bislang ist für beide Schritte nicht eindeutig geklärt, welcher Teilprozess den limitierenden
Faktor darstellt. Allerdings kann der erste Schritt beschleunigt werden, indem thermodynamisch
instabile siRNAs für die RISC-Beladung eingesetzt werden [178, 179, 186, 192197].
Wäre dies der einzige limitierende Faktor, müssten alle Komplexe, die mit unterschiedlicher
siRNA programmiert sind, ihre target RNA mit der gleichen Ezienz spalten, was nicht der
Fall ist. Daher postulierte Rana, dass die katalytische Kontrolle des zweiten Schrittes einen
kritischen Parameter für eine eziente RNAi unter physiologischen Bedingungen darstellt.
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