Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Reinigung von hTRBP-His unter nicht-denaturierenden Bedingungen im
präparativen Maÿstab
Puer
Komponente
Lysispuer (1 ×) 20 mM Tris (pH 7,5)
50 mM NaCl
1 mM PMSF
5 mM β-Mercaptoethanol
5 mM Imidazol
Waschpuer (1 ×) 20 mM Tris (pH 7,5)
50 mM NaCl
1 mM PMSF
5 mM Imidazol
Elutionspuer (1 ×) 20 mM Tris (pH 7,5)
200 mM Imidazol
50 mM NaCl
Lagerpuer (1 ×) 20 mM Tris (pH 7,5)
50 mM NaCl
10 % (v/v) Glyzerin
1 mM EDTA
Tabelle 4.13: Puerzusammensetzung für die Reinigung von hTRBP-His unter nicht-denaturierenden
Bedingungen.
E. coli Zellen, in denen zuvor die Expression von hTRBP-His induziert worden war (siehe Abschnitt
4.3.6), wurden in 30 ml kaltem Lysispuer pro Gramm resuspendiert. Für die Zelllyse
wurde die Suspension 5 × 20 s mit Ultraschall behandelt (70 % Power und 100 % Cycle, gefolgt
von 30 s Inkubation auf Eis), auf 100 µg/ml mit Lysozym eingestellt, für 15 min bei 4 ◦ C rührend
inkubiert und erneut 10 × 20 s einer Ultraschallbehandlung unterzogen (70 % Power und
100 % Cycle, gefolgt von 30 s Inkubation auf Eis). Per Zentrifugation für 30 min bei 4 ◦ C und
18.000 × g wurden unlösliche Zelltrümmer sedimentiert.
Für die Reinigung mittels Anitätschromatographie wurde die Proteinlösung mit einer
Peristaltik-Pumpe (Flussrate 1 ml/min) auf die mit 10 ml TALON Superow gefüllte und
mit Waschpuer äquilibrierte Säule XK 16/20 gepumpt. Die Beladung erfolgte in einem geschlossenen
Kreislauf für mindestens 16 h, so dass die Proteinlösung das Säulenbett mehrfach
passieren konnte. Danach wurde die Säule mit mindestens 10 Säulenvolumina Waschpuer bei
einer Flussrate von 1 ml/min gewaschen. Die Elution erfolgte durch einen linearen Gradienten
von 5 auf 200 mM Imidazol in 50 min, gefolgt von 30 min Elution mit konstanten 200 mM Imi-
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