Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Die Rückfaltung von hAgo2 erfolgte durch das Entfernen von Harnsto und Einstellen
eines physiologischen pH-Wertes durch Dialyse gegen 2 × 200 ml Rückfaltungspuer. Der während
der Rückfaltung präzipitierte Anteil an Protein wurde mittels Zentrifugation für 20 min
bei 4 ◦ C und 20.000 × g abgetrennt.
Die einzelnen Präparationsschritte wurden mittels SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4.3.3) und
Coomassie-Färbung (siehe Abschnitt 4.3.4) oder Western-Analyse (siehe Abschnitt 4.3.5) untersucht.
Die enzymatische Aktivität von hAgo2 wurde durch die siRNA-vermittelte Spaltung
von target RNA (siehe Abschnitt 4.4.1) bestätigt und somit die Rückfaltung als erfolgreich
betrachtet.
Reinigung von GST-hAgo2-His und GST-hAgo2 unter nicht-denaturierenden
Bedingungen im analytischen Maÿstab
Puer
Komponente
Lysispuer (1 ×) 50 mM Tris (pH 7,4)
1 mM EDTA
1 mM PMSF
10 mM DTT
Bindungspuer (1 ×) 50 mM Tris (pH 7,4)
1 mM EDTA
10 mM DTT
Elutionspuer (1 ×) 50 mM Tris (pH 8,0)
1× Glutathionlösung
(reduziert)
Tabelle 4.12: Puerzusammensetzung für die Reinigung von GST-hAgo2-His bzw. GST-hAgo2 unter
nicht-denaturierenden Bedingungen.
E. coli Zellen, in denen zuvor die Expression von GST-hAgo2-His oder GST-hAgo2 induziert
worden war (siehe Abschnitt 4.3.6), wurden in 30 ml kaltem Lysispuer pro Gramm resuspendiert.
Die Zelllyse erfolgte durch 2 × 1 min Ultraschallbehandlung mit 30 % Power und
60 % Cycle, gefolgt von 1 min Inkubation auf Eis. Die folgende Zentrifugation für 20 min bei
4 ◦ C und 11.000 × g diente der Abtrennung von unlöslichen Zelltrümmern von den gelösten
Proteinen.
Die molekularbiologisch eingeführte GST-Markierung am N-Terminus des Zielproteins erlaubte
einen anitätschromatographischen Reinigungsansatz. Die Proteinlösung wurde
bei 4 ◦ C für mindestens 16 h mit in Bindungspuer äquilibrierter Glutathion Sepharose 4B
unter ständiger Bewegung inkubiert, wobei pro 30 ml Proteinlösung 500 µl Matrix verwendet
72