Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Mass (%)
5.6 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hTRBP
Untersuchung mittels Dynamischer Lichtstreuung
Für eine weiterführende Analyse des Oligomerisierungszustandes von hTRBP-His in Lösung
wurde die Dynamische Lichtstreuung gemessen. Bei dieser Art von Messung tragen groÿe Partikel
übermäÿig zur Erzeugung des Signals bei, wobei der Anteil am Gesamtsignal nicht mit
dem Anteil an der Gesamtmasse der Lösung korreliert. Das bedeutet, dass bereits die Anwesenheit
weniger sehr groÿer Partikel wie Proteinaggregate die Auösung im Bereich von 1 100 nm
beeinussen können. Dieses Problem trat bei der Messung mit der hTRBP-His-Lösung auf.
Eine Zentrifugation bei 20.000 × g war nicht ausreichend, um alle störenden Aggregate zu
entfernen und ein Histogramm mit zufriedenstellender Auösung zu erhalten. Erst durch Zentrifugation
bei 150.000 × g für 1 h konnten Daten gewonnen werden, die Rückschlüsse auf den
Oligomerisierungsgrad von hTRBP-His in einer 12,14 µM Lösung zulassen (siehe Abbildung
5.21).
Für ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 40,4 kDa beträgt der berechnete
hydrodynamische Radius 2,9 nm. Das Regularisierungs-Histogramm von hTRBP-His zeigt
drei distinkte Populationen. Population 1 entspricht am ehesten dem berechneten hydrodynamischen
Radius von monomerem hTRBP-His und könnte deshalb eine mono- oder dimere
Spezies repräsentieren. Sie macht mit 82,2 % den gröÿten Massenanteil nach der Abtrennung
groÿer Aggregate durch Zentrifguation aus. Population 2 könnte entsprechend eine Spezies
repräsentieren, deren Radius etwa doppelt so groÿ ist wie bei Population 1, also Di- oder Tetrameren
entsprechen. Population 3 ist mit 0,3 % nur zu einem geringen Teil vertreten. Diese
Ergebnisse sind konsistent mit früheren Beobachtungen, nach denen hTRBP in vivo [225] und
in vitro [256] Homodimere bilden kann. Weiterhin konnten Yamashita et al. zeigen, dass der
50
40
1
hTRBP
H
30
20
10
0
0,1 1 10 100 1000
2
Rh (nm)
3
Population
R h
(nm)
Pd
(%)
MW-R
(kDa)
Mass
(%)
1 6,9 13,8 310 82,5
2 15,2 13,8 1956 17,2
3 57,7 10,3 44482 0,3
Abbildung 5.21: Regularisierungs-Histogramm der Dynamischen Lichtstreuung durch 12,14 µM
hTRBP-His in Lagerpuer (siehe Abschnitt 4.4.5). Die Messung wurde bei 25 ◦ C durchgeführt. Die
unterschiedliche Breite der Balken im Histogramm erklärt sich durch die logarithmische Abszissenachse.
Mass: Massenanteil. R h : hydrodynamischer Radius. Pd: Polydispersität. MW-R: auf Grundlage
von R h berechnetes Molekulargewicht.
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