Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
wurden. Die derart mit Protein beladene Matrix wurde in die Säule Econo-Column 737-4021
geladen und 3 × mit je 5 Säulenvolumina Bindungspuer bei Raumtemperatur gewaschen. Für
die Elution des Zielproteins wurde die Matrix für 10 min mit 1 Säulenvolumen Elutionspuer
bei Raumtemperatur inkubiert und anschlieÿend die Elutionsfraktionen gesammelt.
Die einzelnen Reinigungsschritte wurden mittels SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4.3.3) und
Coomassie-Färbung (siehe Abschnitt 4.3.4) überprüft und die Zielprotein enthaltenden Elutionsfraktionen
vereinigt.
Reinigung von GST-hAgo2 unter nicht-denaturierenden Bedingungen im
präparativen Maÿstab
Es wurden für die Reinigung im präparativen Maÿstab die gleichen Puer wie bei derjenigen im
analytischen Maÿstab verwendet (siehe Tabelle 4.12), sie sind deshalb nicht erneut aufgeführt.
Der Zellaufschluss bei beiden Reinigungen erfolgte analog mit folgenden Abweichungen:
Für den präparativen Maÿstab wurden E. coli Zellen in 5 ml kaltem Lysispuer pro Gramm
resuspendiert. Die Bedingungen für die Ultraschallbehandlung wurden auf 5 × 1 min mit 80 %
Power und 60 % Cycle, gefolgt von 1 min Inkubation auf Eis, verändert. Die Isolierung gelöster
Proteine erfolgte durch Zentrifugation für 30 min bei 4 ◦ C und 30.000 × g.
Für die anitätschromatographische Reinigung wurde der Überstand mit einer Peristaltik-Pumpe
(Flussrate 0,1 ml/min) auf die 5 ml Glutathion Sepharose High Performance
enthaltende Säule XK 16/20 gepumpt. Die Säule war zuvor mit Bindungspuer äquilibriert
worden. Die Beladung erfolgte in einem geschlossenen Kreislauf für mindestens 16 h, so dass
die Proteinlösung das Säulenbett mehrfach passieren konnte. Der Durchuss wurde bei 4 ◦ C
für eine spätere Verwendung verwahrt. Im Anschluss erfolgte das Waschen der Säule mit
mindestens 10 Säulenvolumina Bindungspuer bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Zielproteine
wurden durch die Verwendung eines Elutionspuers, der reduziertes Glutathion enthielt,
bei einer Flussrate von 0,1 ml/min von der Säulenmatrix eluiert und in Fraktionen von
500 µl gesammelt. Anhand eines aufgezeichneten Chromatogramms der Absorption bei 280 nm
wurden proteinhaltige Fraktionen für eine SDS-PAGE-Analyse ausgewählt (siehe Abschnitt
4.3.3), nach Coomassie-Färbung (siehe Abschnitt 4.3.4) die Konzentration abgeschätzt sowie
die Reinheit beurteilt und die gewünschten Fraktionen vereinigt.
Die Säule wurde durch Waschen mit 10 Säulenvolumina Bindungspuer bei einer Flussrate
von 0,5 ml/min regeneriert und erneut wie beschrieben mit dem Durchuss der ersten Reinigung
beladen, gewaschen und eluiert. Die wiederholte Beladung und Elution führte zu
massiv gesteigerten Ausbeuten und wurde insgesamt bis zu sechs Mal durchgeführt.
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